第六章 免疫沉淀试验

第六章 免疫沉淀试验的思维导图，分享了基本原理、液相免疫沉淀实验、凝胶内免疫沉淀试验、临床应用的知识，一起来看看吧。

免疫沉淀试验

• 基本原理
  • 基本原理
    • 将可溶性抗原与相应抗体置于温度、酸碱度适宜的一定电解质溶液中，两者按适当比例形成沉淀，产生浊度，或在琼脂等凝胶中形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环，并根据所形成的沉淀物计算待测抗原或抗体的含量
  • 分类
    • 液相免疫沉淀试验
      • 透射免疫比浊试验
      • 散射免疫比浊试验
      • 絮状免疫沉淀试验
    • 凝胶内免疫沉淀试验
      • 免疫扩散试验
      • 电泳相结合的免疫电泳技术
  • 特点
    • 阶段性
      • 第一阶段（抗原抗体特异性结合）
        • 快速但不可见，免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率
      • 第二阶段（形成肉眼可见的免疫复合物）
        • 沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物
    • 特异性
    • 抗原性质
      • 可溶性抗原
    • 抗体的选择
      • 多克隆抗体为主
• 液相免疫沉淀实验
  • 絮状免疫沉淀试验
    • 基本原理
      • 将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物
    • 影响
      • 抗原抗体比例
    • 应用
      • 测定抗原抗体反应的最适比例
    • 操作方法
      • 抗原稀释法
      • 抗体稀释法
      • 方阵滴定法
        • 最大沉淀量时的抗原、抗体稀释度确定抗原-抗体反应的最适比
  • 免疫浊度测定
    • 基本原理
      • 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质的含量
    • 优点
      • 稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染
    • 分类
      • 透射免疫比浊试验
      • 散射免疫比浊试验
        • 终点散射比浊试验
          • 基本原理
            • 在抗原-抗体反应达到平衡时测定散射光强度，以知道单位时间内抗原抗体反应速度或免疫复合物的量
          • 评价
            • 反应时间长，灵敏度低于速率散射比浊法（ ug /L）
        • 速率散射比浊试验
          • 速率
            • 单位时间内抗原抗体反应速度或免疫复合物的量
          • 结果
            • 速率峰的峰值与抗原浓度呈正相关
          • 优点
            • 速度快、灵敏度高（ ng / L )
          • 注意
            • 抗原需过量
      • 胶乳增强免疫浊度测定
• 凝胶内免疫沉淀试验
  • 基本原理
    • 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环
  • 常用凝胶
    • 琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶
  • 分类
    • 单向免疫扩散试验（平板法）
      • 定量试验
      • 原理
        • 抗体与待测的抗原，在两者比例合适的部位结合形成淀环，环的大小与抗原的浓度呈正相关
      • 操作（技术要点）
        • 将抗体混入0.9％琼脂糖内（50℃)，未凝固前倾注成平板 凝固后打孔（直径3~5mm) 孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品 置湿盒内37℃ 24~48h观察孔周围是否出现沉淀环
      • 抗原量与环直径关系的两种计算方式
        • Mancini 曲线
          • 适用于
            • 大分子抗原（ IgM )
          • 扩散时间
            • 长，＞48h
          • 常数
            • K=C/d2
          • 曲线
            • 普通坐标纸曲线
        • Fahey 曲线
          • 适用于
            • 小分子抗原（ IgG , IgA )
          • 扩散时间
            • 短，＜24h
          • 常数
            • K=logC/d
          • 曲线
            • 半对数坐标纸曲线
      • 影响因素
        • 抗体质量
        • 标准曲线，质控血清
        • 结果与真实含量不符
          • 单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高
        • 双环现象
          • 不同扩散率抗原性相同的两个组分
      • 应用
        • 血浆蛋白 IgG、IgA、IgM、C3、C4的测定
    • 双向免疫扩散试验（平板法）
      • 鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
      • 定性试验
      • 基本原理
        • 将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线
      • 操作
        • 平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层 凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在3~5mm之间 在相对的孔中加入抗原或抗体 放置湿盒37℃18~24h 观察孔周围是否出现沉淀环
      • 应用
        • 判断抗原或抗体的存在以及相对含量的估计
          • 分析
            • 直线
              • 抗原抗体分子量相等
            • 曲线朝向
              • 分子量
              • 沉淀线弯向分子量大的方向（分子量越小，扩散越快）
            • 远近
              • 浓度
              • 离得越近，浓度越低
        • 分析抗原或抗体相对分子量
        • 分析抗原的性质
          • 分析
            • 吻合相连
              • 抗体与两个抗原中的相同表位结合形成沉淀，但不能说明两个抗原完全相同
            • 沉淀线相交
              • 两个抗原完全不同
            • 相切
              • 两个抗原之间有部分相同
        • 滴定抗体的效价
          • • 出现沉淀线最高的抗体稀释度作为该抗体的效价
          • 操作
            • 固定抗原的浓度，稀释抗体
            • 同时稀释抗原和抗体
        • 鉴定抗原或抗体纯度
          • 多条沉淀线
            • 性质多样
          • 一条沉淀线
            • 性质单一
    • 免疫电泳技术
      • 基本原理
        • 电泳分析+免疫沉淀试验
      • 优点
        • 加快反应的速度
        • 提高灵敏度
        • 增加分辨率
      • 优点分类
        • 对流免疫电泳（CIEP）
          • 基本原理
            • 双向免疫扩散+电泳
          • 通电后
            • 负极（-）
              • 蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动
            • 正极（+）
              • 抗体球蛋白带负电荷较少，借电渗作用向负极泳动
                • 电渗作用：指在电场作用下溶液相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象
          • 结果分析
            • 无沉淀线出现
              • 无相应的抗原
            • 沉淀线位于抗原抗体孔中间
              • 两者比例较适合
            • 沉淀线偏向抗原孔一方
              • 抗体浓度＞抗原浓度
        • 火箭免疫电泳（RIE）
          • 定量试验
          • 基本原理
            • 单向免疫扩散＋电泳
          • 具体过程
            • 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰
          • 结果分析
            • 抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关
          • 应用
            • IgA IgG 蛋白定量
          • 影响因素
            • 琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则
            • 电泳终点时间的确定
            • 标本数量多时应先通电后加样，防止宽底峰形
            • IgG定量时，可用甲醛与 IgG 上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用
        • 免疫电泳（IEP）
          • 原理
            • 区带电泳＋双向扩散
          • 具体操作
            • 将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带
            • 沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散，两者比例合适处形成弧形沉淀线
          • 结果
          • 影响因素
            • 抗原抗体比例不当，需测抗原抗体最适比
            • 抗血清的的抗体谱，混合抗血清的使用
            • 电泳条件直接影响分辨率
          • 应用
            • 纯化抗原和抗体成分的分析
            • 正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定
        • 免疫固定电泳（IFE）
          • 原理
            • 区带电泳＋免疫沉淀试验
          • 具体操作
            • 将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型
          • 结果
          • 优点
            • 分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析
          • 应用
            • 最常用于 M 蛋白的鉴定与分型
            • 用于尿中本周氏蛋白质的检测与 K 、入分型
            • 脑脊液中寡克隆蛋白的检测与分型
        • 交叉免疫电泳（CIEP）
          • 区带电泳+火箭免疫电泳
        • 自动化免疫电泳
• 临床应用
  • 用于
    • 血液、体液中蛋白质的测定
  • 优点
    • 稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合大批量标本检测
  • 缺点
    • 对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术由于电渗的缘故已不推荐使用
    • 免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果不易分析
  • 优点
    • 免疫固定电泳分辨力强，敏感度高，结果易于分析，常用于 M 蛋白的鉴定与分型