Apcmin小鼠的鉴定及饲养

四周龄 SPF 级雌性 Apcmin/+小鼠购买于江苏集萃药康生物科技有限公司，饲养于天津医科大学实验动物中心 SPF 级环境中。相关操作严格按照规定流程进行。每天观察小鼠活动状态、饮水量、饮食量、粪便状态等，每周称量 1 次体重，共饲养 12 周。


Apcmin/+小鼠

• 小鼠的鉴定
  • 组织 DNA 提取
    • ①向 1.5 ml 离心管加入 200 μl Buffer TL, 剪取小鼠部分尾尖组织约置入离心管中，将组织完全制成悬液。
    • ②向制成的悬液中加入 25 μl 蛋白酶 K，在 55℃环境下摇床孵育 1h，之后使用离心机进行离心，13000 rpm，10 min。
    • ③取 220 μl Buffer BL 加入一支新的 1.5 ml 离心管中，吸取上清液至离心管混匀。70℃条件下孵育 10 min 后加入 220 μl 无水乙醇，充分混匀后放入吸附柱并套于收集管中。
    • ④10000 rpm 条件下离心 10 min，弃去废液后再次放入收集管中。
    • ⑤加入 500 μl Buffer KB 缓冲液，离心（10000 rpm，1min），弃去废液后放入收集管中。
    • ⑥加入 500 μl Wash Buffer，离心（10000 rpm，1 min），弃去废液后再次放入收集管中。再次进行以上起始步骤，13000 rpm 条件下开盖离心 2 min，尽可能清除吸附柱内残留乙醇。
    • ⑦将吸附柱移入一支新的 1.5 ml 离心管中，之后将提前预热的 50 μl 洗脱缓冲液Elution Buffer 加入其中，70℃温箱中温育 3 min，温育后在 13000 rpm 条件下开盖离心 1 min，最后将溶液收集至 1.5 ml 离心管中。
  • （2）DNA 浓度测定
    • 将 100 μl Elution Buffer 放入比色皿中并用分光光度计较零。再取 1 μl DNA样品，用 Elution Buffer 将其稀释 100 倍后置入比色皿中，使用分光光度计读出浓度并计算其纯度。
  • （3）PCR 反应体系（表 2.1
  • （4）PCR 循环参数（表 2.2）
  • （5）琼脂糖凝胶电泳法鉴定 PCR 扩增产物
    • ①向 100 ml 的 1×TAE 电泳缓冲液中添加 1.5 g 琼脂糖，混匀后加热 2 min，室温下冷却。
    • ②冷却至 60℃时加入 5 μl 溴化乙淀并充分混匀。
    • ③将溶液灌入制胶架，插入分孔梳子。
    • ④室温下使凝胶凝固，小心取出凝胶放入装满 1×TAE 缓冲液的电泳槽中。
    • ⑤取 1 μl 上样缓冲液与 5 μl 扩增产物混匀，之后吸取混合液加入到凝胶上样孔中，在凝胶左右两边最靠边的上样孔中各加入 3 μl DNA Marker。110V 条件下电泳 15 min。
    • ⑥使用凝胶成像分析系统分析目的基因片段后拍照保存。
  • （6）PCR 产物回收
    • ①切下单一目的 DNA 凝胶条带置于离心管中称重。②取与凝胶条带等体积的 GC Buffer 溶胶液加入到上步骤的离心管中，60℃条件下温育 8 min，每 2 min 轻弹管底以保证充分溶解。
    • ③将溶胶冷却至室温后放入吸附柱并套于收集管中，10000 rpm 条件下离心 1min，弃去废液后将吸附柱再次放回收集管中。
    • ④向吸附柱内加入 500 μl Wash Buffer，10000 rpm 条件下离心 1 min，弃去废液后将吸附柱再次放入收集管中。再次进行以上起始步骤，13000 rpm 条件下开盖离心 3 min，尽可能清除吸附柱内残留乙醇。
    • ⑤将吸附柱移入一支新的 1.5 ml 离心管中，之后将提前预热的 50 μl 洗脱缓冲液Elution Buffer 加入其中，65℃温箱中温育 5 min，温育后在 13000 rpm 条件下离心 1 min，最后收集 DNA 溶液。
    • （7）琼脂糖凝胶电泳法鉴定 PCR 纯化产物并分析目的条带。
• 小鼠饲养
  • 四周龄 SPF 级雌性 Apcmin/+小鼠购买于江苏集萃药康生物科技有限公司，饲养于天津医科大学实验动物中心 SPF 级环境中。相关操作严格按照规定流程进行。每天观察小鼠活动状态、饮水量、饮食量、粪便状态等，每周称量 1 次体重，共饲养 12 周。
• 小鼠分组
  • 20 只四周龄 Apcmin/+小鼠随机分为两组，每组各 10 只，分别为高脂饮食（HFD）组（60%脂肪含量）和对照组（普通饮食，16%脂肪含量），具体饲料相关配比见表 2.3。