炎症相关的硝酸盐促进口腔V. parvula在肠道内异位定植

炎症相关的硝酸盐促进口腔V. parvula在肠道内异位定植：肠道炎症与V.parvula富集有关、硝酸盐呼吸作用扩展了V.parvula的代谢范围、硝酸盐呼吸作用允许V.parvula利用氨基酸生长……

炎症相关的硝酸盐促进口腔V. parvula在肠道内异位定植

• 肠道炎症与V. parvula富集有关
  • 临床研究数据
    • 临床研究队列的纵向研究肠道微生物组数据
      • UC患者粪钙卫蛋白(FC)增加，V. parvula丰度随之增加
      • CD VS non-IBD，结果同上
• 硝酸盐呼吸作用扩展了V. parvula的代谢范围
  • V. parvula特征---获取碳及能量
    • 可以从有机酸中使用发酵代谢物，如乳酸、苹果酸等
    • 可以使用硝酸盐还原代谢
    • 我们假设V. parvula使用炎症相关的硝酸盐在炎症的肠道中扩增。
  • V. parvula培养基类型
    • SK
      • 无
        • V. parvula不能生长
      • +lactate or malate
        • 增加外源性碳源
          • V. parvula可生长
    • SKN
      • +nitrate
        • 没有外源性碳源
          • V. parvula可生长
      • +lactate or malate
        • 外源性碳源+硝酸盐
          • V. parvula生长最好
            • 在硝酸盐存在的情况下，SK培养基中出现替代碳源可以被V. parvula所利用
      • narG::tet
        • =+SK
          • 没有外源性碳源，但有硝酸盐
            • V. parvula不可生长
        • +lactate or malate
          • 外源性碳源+硝酸盐
            • V. parvula生长不好
      • 推测原因：NarHJI基因失活，导致呼吸硝酸盐还原酶失活
  • V. parvula实验细菌类型
    • WT
    • narG::tet
      • 为了确认narGHJI基因簇参与硝酸盐利用，我们生成了一个敲除narG::tet，导致narHJI基因失活
  • 在硝酸盐的作用下，诱导narGHJI操纵子的转录
    • SKL
      • narG、narR无升高
    • SKN
      • narG、narR明显升高
    • SKLN
      • narG、narR无升高
• 硝酸盐呼吸作用允许V. parvula利用氨基酸生长
  • 硝酸盐呼吸作用使V. parvula在SKN培养基上生长
    • 对碳源的分析表明，酵母提取物是生长所必需的
    • 当酵母提取物存在时，没有酪胨会大大降低V. parvula生长（图2a）
    • 我们假设V. parvula能够利用氨基酸和/或多肽作为碳源。
  • 为了评估各种碳源的贡献，我们使用了SKb培养基:0.25%酵母提取物+ SK盐
    • 在硝酸盐呼吸过程中，由于补充了各种蛋白质水解物，导致了剂量依赖性的生长增加（图2b）
    • 在发酵过程中(当硝酸盐缺失时)，V菌无法在添加任何蛋白质水解物的SKb中生长
      • 用液相色谱-质谱(LC-MS)分析消耗的SK培养基，以研究氨基酸或多肽在生长过程中是否被消耗
        • 注意到在不同生长阶段氨基酸的数量显著减少((图2c)
          • 天冬氨酸在指数中期消耗，而谷氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺只有在指数后期缺乏乳酸(首选碳源)时才消耗殆尽。
            • 在硝酸盐呼吸过程中，单独使用天冬氨酸和天冬酰胺能够提高V菌的生物量和生长速度
            • 尽管在缺乏硝酸盐的情况下，天冬氨酸在出现明显的滞后期后也促进V菌生长(图2 d)
        • 在缺乏乳酸的情况下，许多二肽也在指数期后期被消耗(图2e)。
          • 在这些二肽中，那些末端有长链而带电荷的氨基酸，如谷氨酸、赖氨酸或精氨酸，或者在氨基端和羧基端分别存在色氨酸和脯氨酸的肽消耗较少。
          • 在SKb +硝酸盐(SKbN)培养基中，以AlaAla、GlyAsp和AlaGln作为碳源，V菌的生长随GlyAsp的增加而增加(图2f)。
            • 删除质子依赖的Opt家族肽转运体(optA::chl optB::tet双突变体)，但不删除atp依赖的Opp寡肽转运体，消除了这种效应(图2f在10h时)
              • 利用跨膜的质子电化学势梯度将氨基酸或寡肽逆浓度梯度进行跨膜转运的膜蛋白。
              • 硝酸盐呼吸过程中如何使用二肽促进V菌生长？
• 与硝酸盐呼吸有关的代谢变化
  • 为了研究与发酵和呼吸以及硝酸盐呼吸过程中氨基酸/多肽的代谢策略，我们研究V菌的主要代谢产物:丙酸盐（通过琥珀酸脱羧生成的）和乙酸盐（延胡索酸还原的产物）(图3 a, b)
    • 乳酸发酵导致丙酸盐水平升高(图3 c, d)
    • 无论碳源（乳酸）存在与否，在硝酸盐呼吸过程中丙酸盐浓度都很低(图3c,d)
    • 乙酸盐是通过丙酮酸的氧化和脱羧产生的，可以形成ATP，但效率降低(图3a,b)。在发酵和有乳酸存在的硝酸盐呼吸过程中，乙酸盐浓度升高(图3c,d)
    • 在氨基酸/多肽生长过程中，与乳酸生长过程相比，乙酸盐的产生减少，这不仅反映了更多的糖异生代谢，而且减少了通过丙酮酸产生的ATP(图3 b)
    • 在与氨基酸/多肽的呼吸生长过程中，代谢产物(丙酸盐+乙酸盐)的形成减少，也意味着相对较大比例的碳可能可用于生物质合成(图3 e)
    • 标注
  • 接下来，我们试图了解哪些基因在不同的生长条件下有不同的表达。
    • 首先，我们比较了发酵期间与乳酸(SKL)和硝酸盐呼吸(SKLN)生长的细胞的表达谱，这分别代表了口腔和炎症肠道中可能遇到的环境(图3 f, g)
      • 硝酸盐呼吸导致硝酸盐还原酶簇的上调，以及与亮氨酸、组氨酸和血红素合成相关的途径的上调;它还导致富马酸水合酶和甲基丙二酰途径的下调(8倍)，这可能导致厌氧呼吸过程中富马酸和琥珀酸的丙酸生成减少。在硝酸盐呼吸过程中，poxB，编码丙酮酸:泛素氧化还原酶，通道电子到呼吸链，上调了16倍。
    • 接下来，我们比较了硝酸盐呼吸细胞利用氨基酸/多肽(SKN)或乳酸(SKLN)生长的转录组，以分析硝酸盐呼吸过程中对不同碳源的反应(图3 f、h)
      • 对于氨基酸/多肽，参与嘌呤、氨基酸和多肽(optB)利用或运输的基因被上调，这与我们之前的观察一致，即当硝酸盐存在时，氨基酸/多肽支持V菌生长。(图3f,h及图2)。值得注意的是，atp操纵子也随着氨基酸/多肽上调，表明atp操纵子在氧化磷酸化(OP)中具有更决定性的作用。
• 硝酸盐呼吸作用影响小V菌ATP合成
  • 为了了解硝酸盐呼吸如何扩大V菌的代谢库，并促进其在首选碳源的生长，我们评估了在各种生长条件下质子动力(PMF)和ATP合成途径的作用。
    • 为了研究PMF，我们使用了DiOC2(3,3 ' -二乙基氧甲碳菁)染料，该染料随电化学梯度的变化被输送到细胞中，从而反映膜电位的变化。
      • 无论碳源是什么，硝酸盐的存在导致WT细胞的膜电位显著增加，这与NarGHI复合体功能有关（图4a）
    • 2,4-二硝基苯酚（2,4-DNP，一种离子载体，可以运送质子穿过生物膜）可以使氧化磷酸化解偶联化，使得能量被大量消耗却不被用来制造ATP，可以消除膜电位梯度(图4 b)
      • 乳酸发酵过程中，2,4-DNP处理降低了生物能和生长速率，反映出活性PMF的必要性
      • 硝酸盐存在的情况下，添加2,4-DNP到乳酸和氨基酸/多肽中，降低了细菌的生物能和生长速率。在氨基酸/多肽的使用过程中，细菌生长速率的降低比乳酸更显著
      • 表明细菌的生长是以牺牲这些碳源为代价的生长发生在更大的膜电位下(图4b;图3b)
    • 在所有条件下，质子梯度的损耗降低了生长，这意味着PMF对于通过质子依赖转运体的底物运输或通过OP合成ATP至关重要
      • 为了研究PMF的作用，我们首先评估了乳酸和天冬氨酸的运输(图4c,d)。
        • 在没有硝酸盐处理的静止细胞，乳酸和天冬氨酸几乎没有消耗；然而，硝酸盐的添加增加了乳酸的摄入量，但没有增加天冬氨酸的摄入量(扩展图6b)。生长中的细胞消耗乳酸，硝酸盐进一步刺激乳酸的消耗(图4c)
        • 在narG::tet细胞中，硝酸盐添加刺激乳酸消耗的差异消失了，表明这种增强依赖于硝酸盐呼吸(图4d)。然而，还不确定为什么缺乏硝酸盐的narG::tet细胞比WT细胞更快地消耗乳酸。生长中的细胞消耗了少量的天冬氨酸，但添加硝酸盐没有影响(图4c)。
        • 因此，硝酸盐呼吸作用通过促进以PMF依赖方式运输的营养物质的吸收，直接促进V的生长。
    • 然后我们用一个缺乏ATP合酶的菌株(ATP::tet)来评估PMF在ATP合成中的重要性，ATP合酶是一种将ATP合成和质子运输到细胞质中的复合酶(图5a)。
      • 缺乏ATP合酶的细胞在发酵过程中无法与乳酸一起生长，但在硝酸盐呼吸过程中生长几乎与WT一样好(图5b)。
        • 硝酸盐允许atp::tet生长，但不能通过OP产生ATP，这意味着，对于乳酸，ATP的产生主要是通过底物水平磷酸化(SLP)。因此，必须利用硝酸盐产生的PMF以促进底物的摄取。
    • 为了进一步了解在发酵和呼吸过程中PMF的作用以及SLP和OP对ATP合成的贡献，我们测量了WT和ATP::tet细胞中的ATP水平。
      • 乳酸的添加增加了WT细胞的ATP水平，但对atp::tet细胞无影响。补充乳酸和硝酸盐显著提高了WT和atp::tet细胞中的ATP水平，进一步证实当存在乳酸时，ATP主要是通过SLP产生的(图5c)。
        • 这也表明，在乳酸发酵过程中，可能需要ATP合酶的逆反应来生成PMF并激活质子依赖性的乳酸摄取(图5a)。补充硝酸盐后，atp::tet细胞产生的ATP大约是WT细胞产生的atp的一半(图5c在20和40分钟时)。因此，当V菌利用氨基酸/多肽生长时，ATP合成需要OP。当细胞与氨基酸/多肽一起生长时，这与atp操纵子的更强的诱导一致(图3f,g)。
• 炎症期间的V. parvula扩张依赖于硝酸盐
  • 我们接下来评估了这种代谢开关对V菌定植发炎肠道的能力的重要性
    • 首先，我们研究了上皮损伤和结肠炎是否会导致V菌在限菌小鼠模型中的扩张
      • 我们用3%硫酸葡聚糖钠(DSS)或对照溶液预先定植特定共生菌群组合（ ASF）小鼠8 d，第4天灌胃WT或narG::tet(图6a)
        • 通过炎症细胞因子的产生、中性粒细胞的膨胀和体重和结肠长度的减少，DSS处理的小鼠明显出现炎症(图6b、c)。
        • 通过qPCR检测粪便中V菌丰度的急剧增加，而绝对的16S核糖体RNA计数则不受影响(图6d,e)。我们之前的体外实验没有发现当硝酸盐缺失时narG::tet的生长缺陷(图1d)，这使我们能够测试硝酸盐呼吸在炎症期间Veillonella扩张中的重要性。
        • 在炎症过程中，narG::tet菌株也会扩增，但其丰度明显低于WT(图6d)。narG基因被上调，为体内硝酸盐利用提供了进一步的证据(图6f)
  • 为了进一步评估体内硝酸盐呼吸，我们进行了一个竞争实验：在ASF小鼠在相同的剂量和时间点接受1:1的WT(chl)和narG::tet菌株作为单定殖实验
    • 通过qPCR检测，WT(chl)在炎症肠道中的定植水平明显高于narG::tet(抗体)(图6g)
    • 通过评估对照组和DSS处理小鼠的粪便和结肠组织中的菌落形成单位，进一步证实了炎症期间narG::tet的适应度降低。与对照组相比，DSS处理的ASF小鼠的粪便和结肠组织中WT V. parvula分别多出10倍和100倍(图6h，图i)
    • 这表明炎症促进了V菌的移植或为扩张提供了更多机会。
  • 然后，我们研究了细小弧菌是否可以在具有更复杂肠道菌群的小鼠上定植，这反映了人类肠道中含有其他硝酸盐利用物，并将我们的单一定植模型适应于来自特定无病原体(SPF)环境的小鼠(图6a)
    • 鉴于这些小鼠具有较高的定植抗性，我们在实验终点前用WT或narG::tet灌胃三次(第2、4和6天)。DSS处理的小鼠再次显示体重和结肠长度减少(图6j,k)。
    • 在炎症期间，WT V. parvula在肠内的扩张能力增强，并超过了narG::tet(图6l)。V菌在SPF小鼠肠道中的定植是可变的，需要额外的接种，反映出小鼠微生物群对人类来源的口腔微生物的耐药性增加
  • 为了进一步了解炎症相关的硝酸盐在V. parvula增殖中的作用，我们比较了V. parvula在WT和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)敲除(KO) SPF小鼠中的定植
    • 先前的研究表明，炎症期间肠道中的游离硝酸盐主要来自免疫细胞中的iNOS活性。
    • DSS处理对WT和iNOS KO小鼠结肠长度的影响相同(扩展数据图9f)，但与WT小鼠相比，iNOS缺陷小鼠粪便中的Veillonella丰度显著降低(图6m)，与narG::tet进行表型定植(图6d,l)。
    • 总的来说，这些结果表明V. parvula利用宿主细胞中iNOS活性产生的炎症相关的硝酸盐异位定植肠道。
• V. parvula膜结合的呼吸硝酸盐还原酶是NarGHI基因簇编码，由两个不同位置的操纵子组成，硝酸盐氧化还原酶和NarK硝酸盐/亚硝酸盐转运子(narGHJI和NarK操纵子)。
  • 为了确认narGHJI基因簇参与硝酸盐利用，我们生成了一个敲除narG::tet，导致narHJI基因失活。