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DNA的合成
生物化学与分子生物学第十二章DNA的合成学习笔记，包括DNA复制的基本规律、DNA复制的酶学和拓补学、原核生物DNA复制过程、真核生物DNA复制过程等等。
编辑于2022-11-02 10:35:01 广东- DNA的合成
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DNA的合成
概述
生物体内或细胞内进行的DNA合成
本章主要讨论DNA复制和DNA逆转录合成，DNA修复合成将在下一章叙述。
主要包括DNA复制、DNA修复合成和逆转录合成DNA等过程
DNA复制是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程
在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子
化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应
DNA的忠实复制以碱基配对规律为分子基础，酶促修复系统可以校正复制中可能出现的错误
（动画12-1“复制发生的化学反应”）。
原核生物和真核生物DNA复制的规律和过程相似，但在具体细节上有许多差别，真核生物DNA复制过程和参与的分子更为复杂和精致
第一节 DNA复制的基本规律
概述
DNA复制主要特征
半保留复制
双向复制
半不连续复制
DNA的复制具有高保真性
一、DNA以半保留方式进行复制
DNA生物合成的半保留复制
亲代DNA模板在子代DNA中的存留有3种可能性，全保留式、半保留式或混合式（图12-1a）（详见第九版生物化学P232）。
DNA生物合成的半保留复制规律是遗传信息传递机制的重要发现之一
在复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链
1958年， MeselsonM和 StahlFW用实验证实自然界的DNA复制方式是半保留式的
他们利用细菌能够以NH4Cl为氮源合成DNA的特性，细菌在含15NH4Cl的培养液中培养若干代（每一代约20分钟），此时细菌DNA全部是含15N的“重”DNA；再将细菌放回普通的14NH4Cl培养液中培养，新合成的DNA则有14N的掺入；提取不同培养代数的细菌DNA做密度梯度离心分析，因15N-DNA和14N-DNA的密度不同，DNA因此形成不同的致密带。结果表明，细菌在重培养基中生长繁殖时合成的15N-DNA是1条高密度带；转入普通培养基培养1代后得到1条中密度带，提示其为15N-DNA链与14N-DNA链的杂交分子；在第二代时可见中密度和低密度2条带，表明它们分别为15N-DNA链/14N-DNA链、14N-DNA链/14N-DNA链组成的分子（图12-1b）（详见第九版生物化学P232）。随着在普通培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带保持不变。
这一实验结果证明，亲代DNA复制后，是以半保留形式存在于子代DNA分子中的
半保留复制规律的阐明，对于理解DNA的功能和物种的延续性有重大意义
依据半保留复制的方式，子代DNA中保留了亲代的全部遗传信息，亲代与子代DNA之间碱基序列高度一致
（图12-2）详见第九版生物化学P233。
遗传的保守性是相对而不是绝对的，自然界还存在着普遍的变异现象
遗传信息的相对稳定是物种稳定的分子基础，但并不意味着同一物种个体与个体之间没有区别
病毒是简单的生物，流感病毒就有很多不同的毒株，不同毒株的感染方式、毒性差别可能很大，在预防上有相当大的难度
地球上曾有过的人口和现有的几十亿人，除了单卵双胞胎之外，两个人之间不可能有完全一样的DNA分子组成（基因型）
在强调遗传保守性的同时，不应忽视其变异性
二、DNA复制从起点双向进行
细胞的增殖有赖于基因组复制而使子代得到完整的遗传信息
原核生物基因组复制
原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点
复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制
（图12-3a）详见第九版生物化学P234。
复制叉
复制中的模板DNA形成2个延伸方向相反的开链区
指的是正在进行复制的双链DNA分子所形成的Y形区域
已解旋的两条模板单链以及正在进行合成的新链构成了Y形的头部
尚未解旋的DNA模板双链构成了Y形的尾部
真核生物基因组复制
真核生物基因组庞大而复杂，由多个染色体组成全部染色体均需复制，每个染色体又有多个起点，呈多起点双向复制特征
（图12-3b）详见第九版生物化学P234。
每个起点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接
复制子
从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域
是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位
高等生物有数以万计的复制子，复制子间长度差别很大，约在13～900kb之间
三、DNA复制以半不连续方式进行
1968年，冈崎用电子显微镜结合放射自显影技术观察到，复制过程中会出现一些较短的新DNA片段，后人证实这些片段只出现于同一复制叉的一股链上
由此提出，子代DNA合成是以半不连续的方式完成的，从而克服DNA空间结构对DNA新链合成的制约
DNA双螺旋结构的特征之一是两条链的反向平行，一条链为5’至3’方向，其互补链是3’至5’方向。DNA聚合酶只能催化DNA链从5’至3’方向的合成，故子链沿着模板复制时，只能从5’至3’方向延伸。在同一个复制叉上，解链方向只有一个，此时一条子链的合成方向与解链方向相同，可以边解链，边合成新链。然而，另一条链的复制方向则与解链方向相反，只能等待DNA全部解链，方可开始合成，这样的等待在细胞内显然是不现实的。
半不连续复制
前导链连续复制而后随链不连续复制的方式
（图12-4）详见第九版生物化学P234。
两条互补链的合成是不对称的
前导链
在DNA复制过程中，沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的
后随链
复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能随着模板链的解开，逐段地从5’→3’生成引物并复制子链
模板被打开一段，起始合成一段子链，再打开一段，再起始合成另一段子链，呈不连续复制
沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段
真核冈崎片段长度100～200核苷酸残基，而原核是100～2000核苷酸残基
复制完成后，这些不连续片段经过去除引物，填补引物留下的空隙，连接成完整的DNA长链
在引物生成和子链延长上，后随链都比前导链迟一些
四、DNA复制具有高保真性
DNA复制具有高度保真性，其错配概率约为10*（-10）
“半保留复制”确保亲代和子代DNA分子之间信息传递的绝对保真性
高保真DNA聚合酶利用严格的碱基配对原则是保证复制保真性的机制之一
体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性
DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校读功能以及复制后修复系统（光复活修复、剪切修复、重组修复、SOS）对错配加以纠正
四种机制协同进一步提高了复制的保真性
真核细胞有许多DNA聚合酶，复制酶以高保真度运作
细菌复制酶有多个错误修复系统。
复制酶有复杂的结构，不同亚基具有不同功能
（表12-1）详见第九版生物化学P235。
除了β酶，修复酶都有低保真度，修复酶的结构相对简单
第二节 DNA复制的酶学和拓补学
概述
DNA复制
是酶促核苷酸聚合反应
底物是 dNTP
dATP、dGTP、dCTP和dTTP
有3个磷酸基团
最靠近核糖的称为α-P，向外依次为β-P和γ-P
在聚合反应中，α-P与子链末端核糖的3’-OH连接
底物的5’-P是加合到延长中的子链（或引物）3’-端核糖的3’-OH基上生成磷酸二酯键的
因此新链的延长只可沿5’向3’方向进行
模板
指解开成单链的DNA母链，遵照碱基互补规律，按模板指引合成子链，子链延长有方向性
引物
提供3’-OH末端使dNTP可以依次聚合
复制的基本化学反应
（图12-5）详见第九版生物化学P236。图12-5的反应可简示为:（dNMP）n＋dNTP→（dNMP）n＋1＋PPi。N代表4种碱基的任何一种。
核苷酸和核苷酸之间生成3’，5’-磷酸二酯键而逐一聚合
一、DNA聚合酶催化脱氧核糖核苷酸间的聚合
简述
DNA聚合酶
DNApol是1958年由 Kornberg A在E.coli中首先发现的。他从细菌沉渣中提取得到纯酶，在试管内加入模板DNA、dNTP和引物，该酶可催化新链DNA生成。这一结果直接证明了DNA是可以复制的，是继DNA双螺旋模型确立后的又一重大发现。当时将此酶称为复制酶。在发现其他种类的 DNA pol后， Kornberg A发现的DNA聚合酶被称为DNA pol Ⅰ。
全称是依赖DNA的DNA聚合酶（DNA pol）
可催化新链DNA生成
（一）原核生物至少有5种DNA聚合酶
大肠杆菌经人工处理和筛选，可培育出基因变异菌株。 DNA polⅠ基因缺陷的菌株，经实验证明照样可进行DNA复制。 从变异菌株中相继提取到的其他 DNA pol被分别称为 DNA pol Ⅱ和 DNA polⅢ 。
具有5′→3’延长脱氧核苷酸链的聚合活性及3’→5′核酸外切酶活性
DNA pol Ⅰ
由polA编码，主要在DNA损伤修复中发挥作用，在半保留复制中起到辅助作用
DNA polⅠ的二级结构以α-螺旋为主，只能催化延长约20个核苷酸左右
说明它不是复制延长过程中起主要作用的酶
DNA polⅠ在活细胞内的功能主要是对复制中的错误进行校对，对复制和修复中出现的空隙进行填补
用特异的蛋白酶可以将 DNA polⅠ水解为2个片段
小片段共323个氨基酸残基，有5′→3’核酸外切酶活性
大片段共604个氨基酸残基（ Klenow片段），具有DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性
Klenow片段是实验室合成DNA和进行分子生物学研究常用的工具酶
DNA polⅡ
由polB编码，当复制过程被损伤的DNA阻碍时重新启动复制叉
DNA polⅡ基因发生突变，细菌依然能存活，推想它是在polⅠ和polⅢ缺失情况下暂时起作用的酶
DNA polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合
因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复
DNA polⅢ
由polC编码，聚合反应比活性远高于polⅠ，每分钟可催化多至10*5次聚合反应
是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶
由10种（17个）亚基组成的不对称异聚合体
（图12-6）详见第九版生物化学P236。
由2个核心酶通过1对β亚基构成的滑动夹与y-复合物、即夹子加载复合体连接组成
核心酶由a、ε、θ亚基共同组成，主要作用是合成DNA，有5′→3’聚合活性
ε亚基是复制的保真性所必需 β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用
其余的7个亚基统称y-复合物，包括γ、δ、δ’、ψ、χ和两个τ，有促进滑动夹加载、全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用
DNA pol Ⅳ
由dinB编码
DNA polⅤ
由umu’2C编码
属于跨损伤合成DNA聚合酶
（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种
真核细胞的DNA聚合酶至少15种，常见的有5种，它们在功能上与原核细胞的比较见表12-2（详见第九版生物化学P237）。至于高等生物中是否还有独立的解旋酶和引物酶，目前还未能确定。但是，在病毒感染培养细胞（HeLa/SV40）的复制体系中，发现SV40病毒的T抗原有解旋酶活性。
聚合酶转换
DNA polα合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的DNA polδ和 DNA polε所替换的过程
DNA polδ负责合成后随链
DNA polε负责合成前导链
DNA pol α催化新链延长的长度有限，但它能催化RNA链的合成，因此认为它具有引物酶活性
DNA pol β复制的保真度低，可能是参与应急修复复制的酶
DNA pol γ是线粒体DNA复制的酶
二、DNA聚合酶的碱基选择和校读功能
简述
DNA复制的保真性是遗传信息稳定传代的保证
生物体实现保真性的机制
遵守严格的碱基配对规律
聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能
复制出错时有即时的校对功能
（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择
DNA复制保真的关键是正确的碱基配对，而碱基配对的关键又在于氢键的形成
G和C以3个氢键、A和T以2个氢键维持配对，错配碱基之间难以形成氢键
除化学结构限制外，DNA聚合酶对配对碱基具有选择作用
DNA pol Ⅲ
DNA polⅢ的10个亚基中，以α、ε和θ作为核心酶并组成较大的不对称二聚体
对各亚基功能的深入研究认为，在核苷酸聚合之前或在聚合当时，酶就可以控制碱基的正确选择。
α亚基有5’→3’聚合酶活性
ε有3’→5’核酸外切酶活性以及碱基选择功能
θ亚基未发现有催化活性，可能起维系二聚体的作用
利用“错配”实验发现， DNA polⅢ对核苷酸的掺入具有选择功能
DNA pol是在DNA链延长中起催化作用的酶。例如，用21聚腺苷酸poly（dA）21作模板，用poly（dT）20作复制引物，观察引物的3’-OH端连上的是否为胸苷酸（T）。尽管反应体系中4种核苷酸都存在，第21位也只会出现T。若仅仅加入单一种类的dNTP作底物，就会“迫使”引物在第21位延长中出现错配。用柱层析技术可以把 DNA polⅢ各个亚基组分分离，然后再重新组合。如果重新组合的DNA pol Ⅲ不含ε亚基，复制错配频率出现较高，说明ε亚基是执行碱基选择功能的。
DNA polⅢ对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实现其选择功能
DNA中脱氧核糖以糖苷键与碱基连接，此键有顺式和反式两种构象。在B-DNA（右手双螺旋）中，如果碱基是嘌呤，DNA糖苷键总是反式，与相应的嘧啶形成氢键配对。而要形成嘌呤-嘌呤配对，则其中一个嘌呤必须旋转180°。
（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正
错配修复
原核生物的 DNA polⅠ、真核生物的 DNA pol δ和DNA pol ε的3’→5’核酸外切酶活性都很强，可以在复制过程中辨认并切除错配的碱基，对复制错误进行校正的过程
以 DNA polⅠ为例（图12-7）（详见第九版生物化学P238）。图中的模板链是G，新链错配成A而不是C。 DNA polⅠ的3’→5′外切酶活性将错配的A水解下来，同时利用5′→3’聚合酶活性补回正确配对的C，复制可以继续下去，这种功能称为校对。
DNA polⅠ
具有3’→5′外切酶活性
校对功能
实验也证明如果是正确的配对，3’→5’外切酶活性是不表现的
5′→3’外切酶活性
实施切除引物、切除突变片段的功能
三、复制中DNA分子拓补学变化
DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有解成单链，才能发挥模板作用。 WatsonJ和 CrickF在建立DNA双螺旋结构模型时曾指出，生物细胞如何解开DNA双链是理解复制机制的关键。目前已知，多种酶和蛋白质分子共同完成DNA的解链。
（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态
复制起始时，需多种酶和辅助的蛋白质因子，共同解开并理顺DNA双链，且维持DNA分子在一段时间内处于单链状态
（表12-3）详见第九版生物化学P238。 大肠杆菌（E.coli）结构简单，繁殖速度快，是较早用于分子遗传学研究的模式生物。对大肠杆菌变异株进行分析，可以阐明各种基因的功能。早期发现的与DNA复制相关的基因曾被命名为dnaA、dnaB、…、dnaX等，分别编码DnaA、DnaB等蛋白质分子。 DNA分子只要碱基配对，就会有形成双链的倾向。
DnaA
辨认复制起点
DnaB（解旋酶）
利用ATP供能来解开DNA双链
DnaC
运送和协同DnaB
E. coli DNA复制起始的解链是由DnaA、DnaB和DnaC共同起作用而发生的
单链结合蛋白（SSB）
具有结合单链DNA的能力，维持模板的单链稳定状态并使其免受细胞内广泛存在的核酸酶的降解
SSB作用时表现协同效应，保证SSB在下游区段的继续结合
可见，它不像聚合酶那样沿着复制方向向前移动，而是不断地结合、脱离
（二）DNA拓补异构酶改变DNA超螺旋状态
DNA拓扑异构酶（拓扑酶）
拓扑一词，在物理学上是指物体或图像作弹性移位而保持物体原有的性质。DNA双螺旋沿轴旋绕，复制解链也沿同一轴反向旋转，复制速度快，旋转达100次/秒，会造成复制叉前方的DNA分子打结、缠绕、连环现象。DNA在复制解链过程形成超螺旋结构的形态见图12-8。这种超螺旋及局部松弛等过渡状态，需要拓扑酶作用以改变DNA分子的拓扑构象，理顺DNA链结构来配合复制进程。
分布
广泛存在于原核及真核生物
组成
Ⅰ型
Ⅱ型
原核生物拓扑异构酶Ⅱ又称促旋酶
真核生物的拓扑酶Ⅱ还有几种不同亚型
Ⅲ型
作用
改变DNA分子的拓扑构象，理顺DNA链结构来配合复制进程
机制
拓扑酶既能水解，又能连接DNA分子中磷酸二酯键
（图12-9）详见第九版生物化学P239。
可在将要打结或已打结处切口，下游的DNA穿越切口并作一定程度旋转，把结打开或解松，然后旋转复位连接
主要有两类拓扑酶在复制中用于松解超螺旋结构
拓扑酶Ⅰ可以切断DNA双链中一股，使DNA解链旋转中不致打结，适当时候又把切口封闭，使DNA变为松弛状态，这一反应无需ATP
拓扑酶Ⅱ可在一定位置上，切断处于正超螺旋状态的DNA双链，使超螺旋松弛；然后利用ATP供能，松弛状态DNA的断端在同一个酶的催化下连接恢复
使复制中的DNA解开螺旋、连环或者解连环，达到适度盘绕
母链DNA与新合成链也会互相缠绕，形成打结或连环，也需拓扑异构酶Ⅱ的作用
DNA分子一边解链，一边复制，所以复制全过程都需要拓扑酶
四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口
DNA连接酶
连接DNA链3’-OH末端和另一DNA链的5’-P末端，两者间生成磷酸二酯键，从而将两段相邻的DNA链连接成完整的链
（动画12-3“DNA连接酶”）。
连接酶的催化作用需要消耗ATP
图12-10显示连接酶的催化作用
图12-10（详见第九版生物化学P240）图的上部说明其作用于互补双链上的一股不连续的DNA链；图的下部显示DNA连接酶的催化作用。
连接酶只能连接双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的DNA单链或RNA单链的作用
复制中的后随链是分段合成的，产生的冈崎片段之间的缺口，要靠连接酶接合
DNA连接酶不但在复制中起最后接合缺口的作用，在DNA修复、重组中也起接合缺口作用
如果DNA两股都有单链缺口，只要缺口前后的碱基互补，连接酶也可连接
因此它也是基因工程的重要工具酶之一
第三节 原核生物DNA复制过程
原核生物染色体DNA和质粒等都是共价环状闭合的DNA分子，复制过程具有共同的特点，但并非绝对相同，下面以大肠杆菌DNA复制为例，介绍原核生物DNA复制的过程和特点。
一、复制的起始
起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白质因子在复制起点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。
（一）DNA的解链
1.辅助有固定起点
复制不是在基因组上的任何部位随机起始
E.coli上有一个固定的复制起点（oriC）
跨度为245bp
组成
（图12-11）详见第九版生物化学P241。
5组由9个碱基对组成的串联重复序列，形成DnaA结合位点
3组由13个碱基对组成的串联重复序列的富含AT区
DNA双链中，AT间的配对只有2个氢键维系，故富含AT的部位容易发生解链
（动画12-4“DNA解成单链”）。
2.DNA解链需多种蛋白质参与
过程
DnaA蛋白是一同源四聚体，负责辨认并结合于oriC的串联重复序列（AT区）上
然后，几个DnaA蛋白互相靠近，形成DNA-蛋白质复合体结构，促使AT区的DNA解链
DnaB蛋白（解旋酶）在DnaC蛋白的协同下，结合并沿解链方向移动，使双链解开足够用于复制的长度，并且逐步置换出DnaA蛋白
DNA的解链过程由DnaA、DnaB、DnaC三种蛋白质共同参与完成
此时，复制叉已初步形成
SSB（单链结合蛋白）此时结合到DNA单链上在一定时间内使复制叉保持适当的长度，有利于核苷酸依模板掺入。
3.解链过程中需要DNA拓补异构酶
解链是一种高速的反向旋转，其下游势必发生打结现象
拓扑异构酶Ⅱ通过切断、旋转和再连接的作用，实现DNA超螺旋的转型，即把正超螺旋变为负超螺旋
实验证明负超螺旋DNA比正超螺旋有更好的模板作用
从道理上也是可以理解的:扭得不那么紧的超螺旋当然比过度扭紧的更容易解开成单链。
（二）引物合成和起始复合物的形成
引物的合成
复制起始过程需要先合成引物。
引物
由引物酶催化合成的短链RNA分子
引物长度约为5～10个核苷酸不等
引物合成的方向也是自5’-端至3’-端
已合成的引物必然留有3’-OH末端，此时就可进入DNA的复制延长
（动画12-7“复制叉处的DNA合成”）。
在 DNA polⅢ催化下，引物末端与新配对进入的dNTP生成磷酸二酯键
新链每次反应后亦留有3’-OH，复制就可继续进行下去
引物酶
引物酶是复制起始时催化RNA引物合成的酶。它不同于催化转录的RNA聚合酶（见第十四章）。利福平是转录用RNA pol的特异性抑制剂，而引物酶对利福平不敏感。
属于RNA聚合酶
RNA聚合酶不需要3’-OH便可催化NTP的聚合
母链DNA解成单链后，不会立即按照模板序列将dNTP合为DNA子链。这是因为 DNA pol不具备催化两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键的能力，只能催化核酸片段的3’-OH末端与dNTP间的聚合。
复制起始部位合成的短链引物RNA为DNA的合成提供3’-OH末端，在 DNA pol催化下逐一加入dTP而形成DNA子链
起始复合物的合成
在DNA双链解链基础上，形成含有解旋酶DnaB、DnaC、引物酶和DNA的复制起始区域共同构成的起始复合物结构
在DNA双链解链基础上，形成了DnaB、DnaC蛋白与DNA复制起点相结合的复合体，此时引物酶进入。 该结构在噬菌体ФX系统也称为引发体（动画12-5“引发体的生成”）。
起始复合物蛋白质组分在DNA链上的移动需由ATP供给能量
在适当位置上，引物酶依据模板的碱基序列，从5′→3’方向催化NTP（不是dNTP）的聚合，生成短链的RNA引物
（图12-12）（详见第九版生物化学P242）（动画12-6“引物合成复制起始”）。
二、DNA链的延长
复制中DNA链的延长在 DNA pol催化下进行
原核生物催化延长反应的酶是 DNA polⅢ
底物dNTP的α-磷酸基团与引物或延长中的子链上3’-OH反应后，dNMP的3’-OH又成为链的末端，使下一个底物可以掺入
（动画12-8“复制的延长”）。
复制沿5′→3’延长，指的是子链合成的方向
前导链沿着5′→3’方向连续延长
后随链沿着5′→3’方向呈不连续延长
在同一个复制叉上，前导链的复制先于后随链，但两链是在同一个 DNA polⅢ催化下进行延长的
因为后随链的模板DNA可以折叠或绕成环状，进而与前导链正在延长的区域对齐
（图12-13）（详见第九版生物化学P242）。图中可见，由于后随链作360°绕转，前导链和后随链的延长方向和延长点都处在 DNA polⅢ核心酶的催化位点上。解链方向就是酶的前进方向亦即复制叉向前伸展的方向。因为复制叉上解开的模板单链走向相反，所以其中一股出现不连续复制的冈崎片段。
DNA复制延长速度相当快
以E.coli为例，营养充足、生长条件适宜时，细菌20分钟即可繁殖一代
E.coli基因组DNA全长约4600kb，依此计算，每秒钟能掺入的核苷酸达3800个
三、复制的终止
复制的终止过程
（动画12-9“复制的终止”）。 按照这种方式，所有的冈崎片段在环状DNA上连接成完整的DNA子链。
切除引物
复制的完成还包括去除RNA引物和换成DNA，最后把DNA片段连接成完整的子链。这一过程用图12-14加以说明。实际上此过程在子链延长中已陆续进行，不必等到最后的终止才连接。
由于复制的半不连续性，在后随链上出现许多冈崎片段
每个冈崎片段上的引物是RNA而不是DNA
引物的水解靠细胞核内的 DNA pol Ⅰ，水解后留下空隙
前导链也有引物水解后的空隙，在环状DNA最后复制的3′-OH端继续延长，即可填补该空隙及连接，完成基因组DNA的整个复制过程
填补空缺
空隙的填补由DNA pol Ⅰ，而不是 DNA polⅢ催化，从5′-端向3’-端用dNTP为原料生成相当于引物长度的DNA链
dNTP的掺入要有3’-OH，在原引物相邻的子链片段提供3’-OH继续延伸
由后复制的片段延长以填补先复制片段的引物空隙
填补至足够长度后，还是留下相邻的3’-0H和5’-P的缺口
连接切口
缺口由连接酶连接
原核生物基因是环状DNA，复制是双向复制，从起点开始各进行180°，同时在终止点上汇合
第四节 真核生物DNA复制过程
真核生物的基因组复制在细胞分裂周期的DNA合成期（S期）进行。细胞周期进程在体内受到微环境中的增殖信号、营养条件等诸多因素影响，多种蛋白质因子和酶控制细胞进入S期的时机和DNA合成的速度。真核生物DNA合成的基本机制和特征与原核生物相似，但是由于基因组庞大及核小体的存在，反应体系反应过程和调节均更为复杂。
一、真核生物DNA复制的起始与原核生物基本相似
真核生物DNA分布在许多染色体上，各自进行复制
每个染色体有上千个复制子，复制的起点很多
复制有时序性
即复制子以分组方式激活而不是同步启动
转录活性高的DNA在S期早期就进行复制
高度重复的序列都是在S期的最后阶段才复制的
卫星DNA、连接染色体双倍体的部位（中心体）和线性染色体两端（端粒）
真核生物复制起点序列较E.coli的oriC复杂
也发现比E.coli的oriC序列长的真核生物复制起点。
自主复制序列（ARS）
酵母DNA复制起点含11bp富含AT的核心序列
A（T）TTTATA（G）TTTA（T）
真核生物复制起始也是打开双链形成复制叉，形成引发体和合成RNA引物
但详细的机制，包括酶及各种辅助蛋白质起作用的先后顺序，尚未完全明了
复制的起始需要 DNA pol α、poleε和polδ的参与
（表12-2）详见第九版生物化学P237。
此外还需解旋酶，拓扑酶和复制因子（RF），如RFA、RFC等
增殖细胞核抗原 （ PCNA）
在复制起始和延长中发挥关键作用
为同源三聚体
功能
具有与E. coli DNA pol Ⅲ的亚基相同的功能和相似的构象
即形成闭合环形的可滑动的DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物-模板链
PCNA使polδ获得持续合成的能力
PCNA尚具有促进核小体生成的作用
PCNA的蛋白质水平也是检验细胞增殖能力的重要指标
二、真核生物DNA复制的延长发生DNA聚合酶转换
聚合酶转换
DNApol α催化合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的 DNA polδ和 DNA polε所替换的过程
DNA polδ负责合成后随链，DNA polε负责合成前导链
真核生物是以复制子为单位各自进行复制的，所以引物和后随链的冈崎片段都比原核生物的短
FEN1和 RNase H等负责去除真核复制RNA引物
实验证明，真核生物的冈崎片段长度大致与一个核小体所含DNA碱基数（135bp）或其若干倍相等。可见后随链的合成到核小体单位之末时， DNA pol δ会脱落， DNA pol α再引发下游引物合成，引物的引发频率是相当高的。polα与polδ之间的转换频率高，PCNA在全过程也要多次发挥作用。以上描述的实际是真核生物复制子内后随链的起始和延长交错进行的复制过程。前导链的连续复制，亦只限于半个复制子的长度。当后随链延长了一个或若干个核小体的长度后，要重新合成引物。
真核生物DNA合成
就酶的催化速率而言，远比原核生物慢，估算为50个dNTP/S
真核生物是多复制子复制，总体速度是不慢的
真核生物在不同器官组织、不同发育时期和不同生理状况下，复制速度大不一样
原核生物复制速度与其培养（营养）条件有关。
三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体
复制后的DNA需要重新装配
原有的组蛋白及新合成的组蛋白结合到复制叉后的DNA链上，真核生物DNA合成后立即组装成核小体
生化分析和复制叉的图像一致表明，核小体的破坏仅局限在紧邻复制叉的一段短的区域内，复制叉的移动使核小体破坏，但是复制叉向前移动时，核小体在子链上迅速形成
核小体组蛋白八聚体的数量是同期合成的一个核小体DNA长度的两倍
核素标记实验证明，原有组蛋白大部分可重新组装至DNA链上，但在S期细胞也大量迅速地合成新的组蛋白
四、端粒酶参与解决体末端复制问题
真核生物DNA复制与核小体装配同步进行，复制完成后随即组合成染色体并从G2期过渡到M期
染色体DNA是线性结构。复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接，都易于理解，因为均在线性DNA的内部完成。
染色体在正常生理状况下复制，是可以保持其应有长度的
某些低等生物作为少数特例，染色体经多次复制会变得越来越短（图12-15）（详见第九版生物化学P244）。早期的研究者们在研究真核生物复制终止时，曾假定有一种过渡性的环状结构帮助染色体末端复制的完成，后来一直未能证实这种环状结构的存在。
染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙
剩下的DNA单链母链如果不填补成双链，就会被核内 DNase酶解
端粒
是真核生物染色体线性DNA分子的末端结构
形态学上染色体DNA末端膨大成粒状，这是因为DNA和它的结合蛋白质紧密结合，像两顶帽子那样盖在染色体两端，因而得名
端粒在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性中有着重要的作用
在某些情况下，染色体可以断裂，这时，染色体断端之间会发生融合或断端被DNA酶降解
但正常染色体不会整体地互相融合，也不会在末端出现遗传信息的丢失
DNA测序发现端粒结构的共同特点是富含T-G短序列的多次重复
如仓鼠和人类端粒DNA都有（Tn Gn）x的重复序列，重复达数十至上百次，并能反折成二级结构
端粒酶
20世纪80年代中期发现了端粒酶。1997年，人类端粒酶基因被克隆成功并鉴定了该酶由三部分组成。
组成
约451nt或150～1300nt的端粒酶RNA（ hTR）
端粒酶协同蛋白1（hTP1）
端粒酶逆转录酶（hTRT）
功能
兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能
端粒酶通过一种称为爬行模型的机制合成端粒DNA
复制终止时，染色体端粒区域的DNA确有可能缩短或断裂。（图12-16）详见第九版生物化学P245。
端粒酶依靠hTR（Tn Gn）x辨认及结合母链DNA（Tn Gn）x的重复序列并移至其3’端，开始以逆转录的方式复制
复制一段后，hTR（AnCn）x爬行移位至新合成的母链3’端，再以逆转录的方式复制延伸母链
延伸至足够长度后，端粒酶脱离母链，随后RNA引物酶以母链为模板合成引物，招募 DNA pol，以母链为模板，在DNA pol催化下填充子链，最后引物被去除
据上述的实验结果，至少可以认为在细胞水平，老化是和端粒酶活性下降有关的
研究发现，培养的人成纤维细胞随着培养传代次数增加，端粒长度逐渐缩短。生殖细胞中端粒长于体细胞成年人细胞中端粒比胚胎细胞中端粒短。
生物个体的老化，受多种环境因素和体内生理条件的影响，不能简单地归结为某单一因素的作用
端粒酶活性不一定与端粒的长度成正比
端粒和端粒酶的研究，在肿瘤学发病机制、寻找治疗靶点上，已经成为一个重要领域。
在增殖活跃的肿瘤细胞中发现端粒酶活性增高
在临床研究中也发现某些肿瘤细胞的端粒比正常同类细胞显著缩短
五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次
真核染色体DNA复制
一个重要特征是复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次
染色体的任何一部分的不完全复制，均可能导致子代染色体分离时发生断裂和丢失。不适当的DNA复制也可能产生严重后果，如增加基因组中基因调控区的拷贝数，从而可能在基因表达细胞分裂、对环境信号的应答等方面产生灾难性后果。
复制的起始分两步进行
这两步分别出现于细胞周期的特定阶段。
复制基因的选择
复制基因是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列
复制基因的选择出现于G1期
在这一阶段，基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物（pre-RC）
复制起点的激活
仅出现于细胞进入S期以后
这一阶段将激活pre-RC，易集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶，并起始DNA解旋
复制起点的激活与细胞周期进程一致
细胞周期蛋白D的水平在G1后期升高，激活S期的CDK（CDK）
复制许可因子是CDK的底物，为发动DNA复制所必需
复制许可因子一般不能通过核膜进入核内，但是在有丝分裂的末期、核膜重组之前可以进入细胞核，与DNA的复制起点结合
等待被刺激进入S期的CDK激活，启动复制
一旦复制启动，复制许可因子即失去活性或被降解
在细胞周期的其他时间内，新的复制许可因子不能进入细胞核内，保证在一个细胞周期内只能进行一次基因组的复制
区别
在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行
E.coli的复制基因是oriC
在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次
六、真核生物线粒体DNA按D环方式复制
线粒体DNA
复制方式
D-环复制
特点
复制起点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别
mtDNA为闭合环状双链结构，第一个引物以内环为模板延伸
至第二个复制起点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸
最后完成两个双链环状DNA的复制
（图12-17）详见第九版生物化学P246。复制中呈字母D形状而得名。
复制时需合成引物
真核生物的 DNA pol γ是线粒体催化DNA复制的DNA聚合酶
线粒体的功能是进行生物氧化和氧化磷酸化
20世纪50年代以前，只知道DNA存在于细胞核染色体中。后来在细菌染色体外也发现能进行自我复制的DNA，例如质粒，以后就利用质粒作为基因工程的常用载体。真核生物细胞器——线粒体，也发现存在mtDDA。人类的 mtDNA已知有37个基因。其中13个mtDNA基因就是为ATP合成有关的蛋白质和酶编码的。其余24个基因转录为tRNA（22个）和rRNA（2个），参与线粒体蛋白质的合成。
mtDNA容易发生突变，损伤后的修复较困难
mtDNA的突变与衰老等自然现象有关，也和一些疾病的发生有关
所以mtDNA的突变与修复，成为医学研究上引起广泛兴趣的科学问题
线粒体内蛋白质翻译时，使用的遗传密码和通用的密码有一些差别
第五节 逆转录
双链DNA是大多数生物的遗传物质。然而，某些病毒的遗传物质是RNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。
一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制
RNA病毒（逆转录病毒）
基因组是RNA而不是DNA
复制方式是逆转录
逆转录的信息流动方向（RNA→DNA）与转录过程（DNA→RNA）相反，是一种特殊的复制方式
并非所有的RNA病毒都是逆转录病毒
逆转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶）
1970年，H. Temin和D. Baltimore分别从RNA病毒中发现。
能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶
三种活性
RNA指导的DNA聚合酶活性
DNA指导的DNA聚合酶活性
RNase H活性
作用需Zn2+为辅因子
合成反应也按照5′→3’延长的规律
从单链RNA到双链DNA的生成过程
（图12-18）详见第九版生物化学P247。 有研究发现，病毒自身的tRNA可用作复制引物。
首先是逆转录酶以病毒基因组RNA为模板，催化dNTP聚合生成DNA互补链，产物是RNA/DNA杂化双链
然后，杂化双链中的RNA被逆转录酶中有 RNase活性的组分水解，被感染细胞内的 RNase H（H＝ Hybrid）也可水解RNA链
RNA分解后剩下的单链DNA再用作模板，由逆转录酶催化合成第二条DNA互补链
前病毒
按上述方式，RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒
前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖
整合
在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组，插入到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达，这种重组方式称为整合
前病毒独立繁殖或整合，可成为致病的原因
二、逆转录的发现发展了中心法则
逆转录现象说明，至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代功能
逆转录酶或逆转录现象的发现是分子生物学研究中的重大事件。中心法则认为，DNA的功能兼有遗传信息的传代和表达，因此DNA处于生命活动的中心位置。
这是对传统的中心法则的挑战
艾滋病病原人类免疫缺陷病毒（HIV）也是RNA病毒，有逆转录活性
对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论，至20世纪70年代初，从逆转录病毒中发现了癌基因。至今，癌基因研究仍是病毒学、肿瘤学和分子生物学领域的重大课题。
cDNA法
。在人类这样庞大的基因组DNA（3.2×109bp）中，要选取其中一个目的基因，有相当大难度。对RNA进行提取、纯化，相对较为可行。取得RNA后，可以通过逆转录方式在试管内操作。用逆转录酶催化dNTP在RNA模板指引下的聚合，生成RNA/DNA杂化双链。用酶或碱把杂化双链上的RNA除去，剩下的DNA单链再作为第二链合成的模板。在试管内以 DNA polⅠ的大片段，即 Klenow片段催化dNTP聚合。第二次合成的双链DNA，称为cDNA。c是互补的意思。
分子生物学研究应用逆转录酶作为获取基因工程目的基因的方法
cDNA就是编码蛋白质的基因，通过转录又得到原来的模板RNA
现在已利用该方法建立了多种不同种属和细胞来源的含所有表达基因的cDNA文库，方便人们从中获取目的基因