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基因诊断和基因治疗
基因诊断和基因治疗已成为现代分子医学的重要内容之一
编辑于2022-11-02 11:57:58 广东- 基因诊断和基因治疗
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基因诊断和基因治疗
概述
人类大多数疾病都与基因变异相关
基因诊断和基因治疗已成为现代分子医学的重要内容之一
人体自身基因结构与功能发生异常，以及外源性病毒细菌的致病基因在人体的异常表达，都可以引起疾病从基因水平检测和分析疾病的发生，确定发病原因及疾病的发病机制，评估个体对疾病的易感性，进而采用针对性手段矫正疾病紊乱状态，是现代医学发展的新方向。
第一节基因诊断
概述
基因诊断在许多重大疾病的早期诊断、鉴别诊断、分期分型、疗效判断、预后的预测等方面有独特优势
基因诊断最早的医学实践始于1976年，美国加州大学旧金山分校的华裔科学家Y.W.kan博士利用DNA片段多态性分析技术，对镰状细胞贫血这一遗传性血红蛋白病进行了特异性产前诊断，开创了基因诊断的历史先河。 伴随着临床手段的不断进步，基因诊断技术已经逐步地从实验研究进入临床应用阶段，作为一种新的诊断模式，广泛地应用于遗传性疾病感染性疾病及肿瘤等疾病的诊断，使基因诊断技术在临床应用方面的作用逐步得到凸显。
一、基因诊断的概念及特点
（一）基因诊断是针对DNA和RNA的分子诊断
（1）定义
人类遗传病基因诊断是分析遗传信息携带分子序列，从而在分子水平上确定疾病的病因所在
广义上凡是用分子生物学技术对生物体的DNA序列及其产物（如mRNA和蛋白质）进行的定性、定量分析，都称为分子诊断
技术角度目前分子诊断方法主要针对DNA分子，涉及功能分析时，还可定量检测DNA（主要是mRNA）和蛋白质等分子
通常将针对DNA和RNA分子诊断称为基因诊断
（2）机制
以遗传物质作为诊断目标，在临床症状和表型发生改变前作出早期诊断，属于病因诊断，并且基因诊断结果还能够提示疾病发生的分子机制
因为绝大部分疾病的表型是由基因结构及其功能异常或外源性病原体基因的异常表达造成的，这也是疾病发生的根本原因
大多数疾病的发生过程都存在基因结构和表达水平的改变
基因诊断正是通过检测与分析基因结构与功能（包括外源病原体基因）及基因表达的异常改变，从而对疾病进行诊断。
单基因病主要由病人某种基因突变，致使其编码的蛋白质生物学功能发生改变
如迪谢内肌营养不良（DMD）是X染色体隐性遗传疾病
抗肌萎缩蛋白基因突变所致肌萎缩蛋白缺乏或功能异常是导致疾病发生的根本原因
遗传学疾病或多基因病（可能与基因组多个较微弱的基因效能累加有关）
心血管疾病、糖尿病、高血压、阿尔茨海默病等疾病不具有典型孟德尔遗传模式
具有明显家族遗传倾向，与某些遗传标记有显著关联性，其致病原因尚未清楚
肿瘤的发生发展具有多因素和多阶段性，每个阶段可能发生基因结构与功能的改变
对感染性疾病来说，病原体侵入必定使病人体内存在病原体的遗传物质
（二）基因诊断在疾病诊断上具有独特的优势
早期医学诊断是根据病人的临床症状和体征来进行判断，随着检验技术手段的提升，逐步发展为以疾病的表型改变为依据，而大部分疾病的表型改变缺乏特异性，并且往往是在疾病的中晚期才出现，常常不能作出及时准确的诊断。相比之下基因诊断不依赖疾病表型改变，直接以致病基因、疾病相关基因、外源性病原体基因或其表达产物为诊断对象，具有特异性强、灵敏度高、可早期诊断、应用性广的独特优势。
1.特异性强
基因诊断属于病因诊断，具有高度特异性
（1）以基因结构（包括病人自身基因和外源性病原体基因）及其表达产物（RNA或蛋白质）为检测对象，而不是疾病表型
（2）基因突变及其功能异常、外源性病原体基因存在是疾病发生根本原因
采用分子生物学技术能够检测出这些特异的碱基序列
判断病人是否发生与携带某些基因突变
是否存在外源性病原体基因
作出特异性诊断
2.灵敏度高
基因诊断常利用PCR和核酸杂交的技术手段
目前临床上，常常把核酸杂交技术与PCR技术联合使用用于检测微量的病原体基因及其拷贝数极少的各种基因突变，具有较高的灵敏度。
（1）PCR技术可将待测核酸样品进行特异性高效扩增达百万倍，亦可对极其微量DNA进行高效扩增
极其微量：几个细胞、一根头发、一滴血迹、组织切片和石蜡包埋组织块中
（2）核酸杂交技术利用核酸杂交特异性，使用了具有生物催化活性的酶、放射性核素标记或荧光素标记的高灵敏度探针来检测
具有很高灵敏度
3.可进行快速和早期判断
绝大部分疾病可应用分子生物学技术进行基因水平的检测，甚至可以在表型未发生改变情况下进行准确早期诊断
人类所患疾病种类繁多各种疾病的表型千差万别，仅依据表型改变难以准确地作出快速和早期诊断。 与传统的诊断技术相比，基因诊断的过程更为简单与直接，如采用细菌培养技术对感染性疾病作出诊断通常需要数天的时间，而采用基因诊断技术只需数个小时。
4.适用性强、诊断范围广
伴随着“人类基因组计划”的完成和“功能基因组计划”的不断推进，已被克隆的疾病基因和疾病相关基因也越来越多人们对许多疾病发生的分子机制有了更深的认识，这为基因诊断的发展提供了坚实的理论基础。
（1）可以在基因水平上对大多数疾病进行诊断
（2）对有遗传病家族史的致病基因携带者作出预警诊断
（3）对有遗传病家族史的胎儿进行产前诊断
（4）评估个体对肿瘤、心血管疾病、精神疾病、高血压等多基因病的易感性和患病风险
（5）进行疾病相关状态分析，包括疾病的分期分型、发展阶段、抗药性等方面
（6）快速检测不易在体外培养和在实验室中培养安全风险较大的病原体，如艾滋病病毒、肝炎病毒、流行性感冒病毒等
二、基因诊断的样品来源广泛
进行基因诊断的前提是疾病表型与基因型的关系已被阐明（见第二十五章）。人类遗传病的表型是由个体基因型决定的，故对遗传病的诊断也可理解为进行个体的基因分型。
临床可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等
。在选择被测样品时，可根据材料来源和分析目的提取其基因组DNA或各种RNA，后者可经逆转录形成cDNA。RNA的分析必须用新鲜样品。在开展胎儿DNA诊断时，除传统的羊水绒毛和脐带血样品外，从母亲外周血中提取胎儿细胞或胎儿DNA的先进技术已经初步应用于临床实践。
三、基因诊断的基本技术日趋成熟
概述
（1）基因诊断包括检测个体的
基因序列特征
基因突变
基因的拷贝数
是否存在病原体基因
（2）基因诊断技术分类
定性分析
基因分型、检测基因突变
定量分析
测定基因拷贝数、基因表达产物量
检测外源感染性病原体基因时，定性分析可诊断其在人体存在与否，而定量分析则可确定其含量
（3）基因诊断基本方法
从理论上来讲，所有检测基因表达水平或基因结构的方法都可用于基因诊断。基因诊断的基本方法几乎全部基于核酸分子杂交和PCR技术，或上述两种技术的联合应用。
核酸分子杂交技术
PCR
DNA测序
基因芯片技术等
（一）核酸分子杂交技术是基因诊断的基本方法
概述
核酸分子杂交技术是基因诊断的最基本的方法之一
不同来源DNA或RNA在一定条件下通过变性和复性可形成杂化双链
通过选择一段已知序列核酸片段作为探针
对其放射性核素、生物素或荧光染料进行标记
然后与目的核酸进行杂交反应
通过标记信号检测就可以对未知目的核酸进行定性或定量分析
1.DNA印迹法
（1）定义
DNA印迹是最为经典的基因分析方法，一般可以显示50～20000bp的DNA片段，片段大小信息是诊断基因缺陷重要依据
（2）优点
检测特异的DNA序列
进行基因的限制性内切核酸酶图谱和基因定位
区分正常和突变样品的基因型
可获得基因缺失或插入片段大小等信息
（3）缺点
难以作为常规临床诊断手段
操作繁琐，费时费力
使用放射性核素
2. Northern印迹法
通过标记DNA或RNA探针与待测样本RNA杂交
对组织或细胞的总RNA或mRNA进行定性或定量分析，及基因表达分析
Northern印迹杂交对样品RNA纯度要求特别高，限制了该技术在临床诊断中的应用。
3.斑点杂交
（1）定义
核酸探针与支持物上DNA或RNA样品杂交，以检测样品中是否存在特异的基因或表达产物
（2）应用
用于基因组中特定基因及其表达产物的定性与定量分析
（3）优缺点
具有简便、快速、灵敏和样品用量少的优点
无法测定目的基因的大小，特异性较低，有一定比例的假阳性
4.原位杂交
（1）定义
细胞生物学技术与核酸杂交技术相结合的一种核酸分析方法，核酸探针与细胞标本或组织标本中核酸杂交，可对特定核酸序列进行定量和定位分析
（2）应用
显示目的核酸序列空间定位的特点
检出含有特定核酸序列的具体细胞，包括其在样品中的位置、数量及类型
检出目的DNA在细胞核或染色体上的分布
组织或细胞感染的细菌或病毒等病原体的检测
与细胞内RNA进行杂交还可以对样本组织细胞中特定基因表达水平进行检测
5.荧光原位杂交
（1）定义
将荧光素或生物素等标记的寡聚核苷酸探针与细胞或组织变性的核酸杂交
对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析
（2）应用
对任何给定基因组区域进行特异性杂交
对中期分裂象染色体及间期细胞核进行分析，可以获得传统显带技术所无法检测到的染色体信息
鉴别染色体数目和结构的异常
特别是能对染色体异常改变进行原位显示和定量分析
适用于新鲜冷冻、石蜡包埋标本及穿刺物和脱落细胞等样品的检测
（二）PCR技术是特异、快速的基因诊断方法
概述
PCR技术能够极其快速、特异性地在体外进行基因或DNA片段的扩增，具有较高的灵敏度
近年来，以PCR为基础的相关实验技术发展迅速，RT-PCR、QRT-PCR、FQ-PCR及 in situ PCR等技术广泛地应用于致病基因的发现、核酸序列分析、DNA多态性分析、遗传疾病及感染性疾病的基因诊断、法医鉴定及个体识别等领域。在临床上，应用PCR技术可以对已知序列或已知部分序列的基因进行检测，或采用PCR技术扩增出已知DNA片段后与其他技术联合应用，衍生出了多种基因诊断技术。
1.直接采用PCR技术进行基因诊断
PCR技术可以直接用于检测待测特定基因序列的存在与缺失
（1）分析疾病相关基因的缺失或突变
1、如跨越基因缺失或插入部位的PCR技术，又称裂口PCR（gap-PCR）
简便灵敏而更适用于临床诊断。
设计并合成一组序列上跨越突变（缺失或插入）断裂点的引物
将待测DNA样本进行PCR扩增
进行琼脂糖凝胶电泳
从扩增片段大小直接判断是否存在缺失或插入突变
2、如多重PCR是一种实用可靠的检测DNA缺失的常用方法
在一次PCR反应中加入多种引物
对一份DNA样本中不同系列片段进行扩增，每对引物扩增产物长度不一
根据电泳图谱上不同长度DNA片段存在与否，判断某些基因片段是否发生缺失或突变
（2）确定病原体基因存在与否
2.PCR-等位基因特异性寡核苷酸分子杂交
（1）PCR-ASO杂交（等位基因特异性寡核苷酸分子杂交）
检测点突变的有效技术（可检测基因上已知的点突变、微小的缺失或插入）
基本原理
图26-1显示以β地中海贫血珠蛋白基因的第17个密码子（CD17）的点突变检测为例的ASO原理示意图。首先，设计合成包含突变位点在内的正常和突变的寡核苷酸探针。将这两个探针进行标记，再分别与待检DNA样品的PCR扩增产物进行杂交和检测。正常人只能与正常序列的ASO探针杂交，突变纯合子只能与突变序列的ASO探针杂交，而突变杂合子则能与两种探针产生杂交信号。
首先使用PCR扩增受检者目标DNA片段
用设计好的ASO探针进行杂交
检测受检者是否存在基因突变及基因突变是杂合子还是纯合子
（2）反向点杂交（RDB）是改进的ASO技术
将针对各种突变和正常序列的ASO探针固定在杂交膜上，而将原来在ASO杂交体系中固定在膜上的PCR产物改为液相进行杂交
ASO分子杂交虽然可以准确地进行已知突变的基因分型，但由于一种突变需要对应一个探针和一组实验，ASO技术对突变类型较少的遗传病诊断较为快速简便。当一种遗传病是由多种点突变所引起，且其频率分散时，ASO技术就显得很繁琐。
一次检测可以同时筛查多种突变，大大提高了基因诊断效率
已在一些常见遗传病，如β地中海贫血和囊性纤维化的基因诊断中得以应用。
3.PCR-限制性片段长度多态性
（1）PCR-RELP技术
定义
将PCR与限制性片段长度多态性（RFLP）结合起来的技术
快速、简便地对已知突变进行基因诊断
基本原理
1)用一种或几种限制性内切核酸酶对某一段DNA序列进行消化
产生大小不同DNA片段，即限制性片段
2)对同种生物来说，不同个体间出现不同长度限制性片段类型称为限制性片段长度多态性
3)基因突变导致基因组成或序列改变使DNA分子中原有的某种限制性内切核酸酶识别位点发生改变
可能导致基因结构中
产生新的限制性内切核酸酶位点
使原有的酶切位点消失
方法
首先是将突变基因PCR扩增，经过相应内切酶消化
1）进行含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离
紫外线灯下即可分辨各种限制性片段的大小或位置
2）或者将限制性酶切产物与核素标记探针进行杂交，进行放射自显影
区分各种片段，解读出目标样品之间DNA分子水平的实际差异
（2）引物介导的限制性分析PCR（PCR-PIRA）
PCR--RFLP技术的延伸
原理是在设计引物时引入错配碱基
从而消除或产生新的酶切位点
错配结果最终表现在酶解的限制性片段长度的差异
主要分析对象是已知基因
PCR--RFLP和PCR-PIRA的主要区别在于后者的引物设计时人工地引入酶切位点，而在实验材料和方法上没有区别。
用相应计算机软件可以分析基因上可能产生的酶切位点的错配，而产生人的 RFLP
（3）巢式PCR-限制性片段多态性（nested PCR-RFLP）
将RFLP与巢式PCR技术相结合，通过设计高度保守序列引物对待检测物种DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行RFLP分析
该方法省时，可应用于流行病学调查和临床常规检测。
4.PCR-单链构象多态性
（1）定义
PCR单链构象多态性（PCR-SSCP）分析，是基于单链DNA构象的差别来检测基因点突变的方法
（2）基本原理
中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间相互作用形成一定空间构象
构象是由其分子碱基序列决定，DNA分子中碱基变异（有时甚至仅一个碱基）可导致其构象发生改变
对于相同长度单链DNA，因碱基组成或排列顺序不同而形成各异构象类型称为单链构象多态性
长度相同但构象类型不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率不同，进而进行鉴别
（3）方法
首先用PCR扩增待测DNA片段
扩增产物变性后成为单链DNA
进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
通过迁移率分析检测基因突变
（4）特点
对于较小DNA片段突变分析比较灵敏
PCR-SSCP方法的灵敏度取决于突变对单链DNA的构象及其在电泳中移速度的影响程度
5.PCR-变性高效液相色谱
（1）定义
如果表型明确指向某种疾病，可采用一类筛查点突变的技术对目的基因进行基因序列扫描，以期发现和确定新的或未知突变类型。PCR-变性高效液相色谱（PCR -DHPLC）是这类技术的代表之一
对临床病例进行基因诊断时，经常会遇到不能检测出已知类型突变的情况。
（2）基本原理
利用待测样品DNA在PCR扩增过程的单链产物可以随机与互补链相结合而形成双链的特性
依据最终产物中是否出现异源双链来判断待测样品中是否存在点突变
如果不存在点突变
PCR反应中产生的双链DNA一致，即只产生一种同源双链
如果存在点突变
产生4种不同DNA双链分子，2种为异源双链，另2种为同源双链
在给定的部分变性洗脱条件下，这些异源双链DNA片段可以在液相色谱柱中呈现出不同的滞留时间，出现“变异”洗脱峰的样品可进一步通过DNA直接测序确定样品的突变位点和性质。这一技术依赖自动化操作的分析仪完成，目前已成为临床遗传学诊断的重要工具。
（三）DNA序列分析是基因诊断最直接的方法
分离出病人的有关基因，测定其碱基排列顺序，找出变异所在是最为直接和确切的基因诊断方法
由于PCR技术和DNA序列分析技术的迅速发展和推广，序列分析已经在技术上和经济上成为最佳的诊断方法，代替了传统的限制性内切酶酶谱分析法此法主要用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断。但由于DNA测序的成本很高，将其作为一种临床上常规的检测方法尚无法实现。
（四）基因芯片技术可用于大规模基因诊断
（1）微量化、大规模、自动化处理样品
同时检测多个基因、多个位点
精确研究各种状态下分子结构的变异
了解组织或细胞中基因表达情况
用以检测基因突变、多态性、表达水平和基因文库作图等
（2）应用
目前利用基因芯片提供了从整体观念研究有机体的全新技术，必将改变生命科学研究的方式，对复杂疾病的诊断与治疗将带来革命性的变化。
早期、快速地诊断地中海贫血、异常血红蛋白病、苯丙酮尿症、血友病、迪谢内肌营养不良症等常见的遗传性疾病
肿瘤诊断方面
肿瘤表达谱研究、突变、SNP检测、甲基化分析、比较基因组杂交分析等
四、基因诊断的医学应用
概述
理论上讲，基因诊断可以提供所有直接或间接涉及基因结构/功能改变的诊断、预警和疗效预测
当人类基因组的信息与人类疾病的关系完全明确以后。虽然目前距离这一目标仍有很长的路要走，但基因诊断在遗传病的临床和预防医学实践上已经获得了较广泛的应用。
（一）基因诊断可用于遗传性疾病诊断和风险预测
（1）遗传性疾病的诊断性检测和症状前检测预警是主要应用领域
在欧美发达国家，遗传病的基因诊断，尤其是单基因遗传病和某些恶性肿瘤等的诊断，已成为医疗机构的常规项目，并已形成在严格质量管理系统下的商业化服务网络。目前已列入美国盛顿大学童医院和区域医学中心主持的著名基因诊断机构—— GENETests网站（http : //www. genetests. org ）为超过3000种遗传性疾病提供分子遗传、生化和细胞生物学检测。 我国基因诊断的研究和应用始于20世纪80年代中期，目前主要开展针对一些常见单基因遗传病的诊断性检测，如地中海贫血、血友病A、迪谢内肌营养不良等，表26-1列举了在我国开展的一些代表性常见单基因病基因诊断及其方法学案例。
对遗传性单基因病，基因诊断可提供最终确诊依据
相比以往细胞学和生化检查，耗时少、准确性高
对特定疾病高风险个体、家庭或潜在风险人群，可实现症状前检测，预测个体发病风险，提供预防依据
（2）基因诊断目前可用于遗传筛查和产前诊断
通过遗传筛查检测出的高风险夫妇需给予遗传咨询和婚育指导，在“知情同意”的原则下于适宜的妊娠期开展胎儿的产前诊断，若胎儿为某种严重遗传病的受累者，可在遗传咨询的基础上由受试者决定“选择”终止妊娠，从而在人群水平实现遗传性疾病预防的目标。例如基于RFLP的连锁分析技术，曾成功地用于包括镰状细胞贫血、β-地中海贫血等多种人类单基因遗传病在内的遗传分析。
（二）基因诊断可用于多基因常见病的预测性诊断
对多基因常见病，基于DNA分析的预测性诊断可为被测者提供某些疾病发生风险的评估意见
如乳腺癌易感基因（BRCA）1号（ BRCA1）和2号（BRCA2）的基因突变可提高个体的乳腺癌发病风险，其基因诊断已成为一些发达国家人群健康监测的项目之一。 针对肿瘤和其他一些多基因常见病的这类预警性风险预测诊断正在逐步走入临床。。预测性基因诊断结果是开展临床遗传咨询最重要的依据。相信在相关基础研究取得进展的基础上，多基因常见病的预测性诊断会越来越多地得到应用成为未来疾病诊断的主要内容。
在一些有明显遗传倾向的肿瘤中，肿瘤抑制基因和癌基因的突变分析，是基因检测的重要靶点
（三）基因诊断可用于传染病病原体检测
（1）针对病原体的基因诊断
针对病原体自身特异性核酸（DNA或RNA）序列，通过分子杂交和基因扩增等手段，鉴定和发现这些外源性基因组、基因或基因片段在人体组织中的存在，从而证实病原体的感染。
主要依赖于PCR技术
高度特异、高度敏感、快速，可以快速检出样品中痕量的、基因序列已知的病原微生物
如组织和血液中SARS病毒、各型肝炎病毒等检测
样品中痕量病原微生物的迅速侦检、分类及分型还可以使用DNA芯片技术
（2）基因诊断主要适用情况
病原微生物的现场快速检测，确定感染源
病毒或致病菌的快速分型，明确致病性或药物敏感性
需要复杂分离培养条件，或目前尚不能体外培养的病原微生物的鉴定
（3）优缺点
较传统方法有更高特异性和敏感性，有利于疾病的早期诊治、隔离和人群预防
难以检测病原体进入体内后机体反应及其结果
由于基因诊断只能判断病原体的有无和拷贝数的多少 因此基因检测并不能完全取代传统的检测方法，它将与免疫学检测等传统技术互补而共存。
（四）基因诊断可用于疾病的疗效评价和用药指导
遗传诊断可应用于临床药物疗效的评价及提供指导用药的信息
例如，急性淋巴细胞性白血病经化疗等综合治疗后，大部分病人可获得缓解，但容易复发。白血病复发的主要根源在于病人体内少数残留的白血病细胞（约＜0.05×109/L）。PCR等基因诊断技术已成为临床上检测和跟踪微小残留病灶的常规方法，是预测白血病的复发、判断化疗效果和制定治疗方案的很有价值的指标。
人群中对药物的反应性存在着个体差异，致使药物的不良反应难以避免
例如，氨基糖苷类抗生素的致聋副作用的发生与线粒体DNA 12S rRNA基因第1555位A→G同质性点突变有关。人群中通过分子筛查发现这种突变的个体，对指导医生避免使用氨基糖苷类抗生素，防止儿童产生药物中毒性耳聋有很好的参考价值。
药物代谢酶类的遗传多态性，也是个体对某些药物反应性差异的重要因素
在系统阐明人类药物代谢酶类及其他相关蛋白的编码基因遗传多态性的基础上，通过对不同药物代谢基因靶点的药物遗传学检测（pharmacogenetic testing），将为真正实现个体化用药提供技术支撑。
通过测定人体基因多态性或其单倍型可以预测药物代谢情况或疗效的反应性，从而制订针对不同个体的药物治疗方案
（五）DNA指纹鉴定是法医学个体识别的核心技术
DNA指纹的遗传学基础是DNA多态性
世界上除了部分同卵双生子外，人与人之间的某些DNA序列特征具有高度的个体特异性和终生稳定性，正如人的指纹一般，故称为DNA指纹（ DNA fingerprinting）。基因诊断在法医学上的应用，主要是采用基于STR的DNA指纹技术进行个体认定（图26-2），已成为刑侦样品的鉴定、排查犯罪嫌疑人、亲子鉴定和确定个体间亲缘关系的重要技术手段。
基于PCR扩增的DNA指纹技术已取代了基于DNA印迹的操作程序
该方法快速、灵敏，以对微量血痕、精液、唾液和毛发进行个体鉴定。
选择若干个基因位点（如STR、人类白细胞抗原位点等）设计相应的PCR引物对
对待测DNA样本进行PCR扩增和带型比较后即可判断结果
第二节基因治疗
概述
（1）定义
基因治疗是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗
即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法
（2）原理
针对异常基因本身
目前基因治疗的概念也有了较大扩展，凡是采用分子生物学技术和原理，在核酸水平上展开的对疾病的治疗都可纳入基因治疗范围。基因治疗的范围也从过去的单基因遗传病扩展到恶性肿瘤、心脑血管疾病、经系统疾病、代谢性疾病等。
目的基因被导入靶细胞内
或与宿主细胞染色体整合成为宿主细胞遗传物质的一部分
或不与宿主细胞染色体整合而独立于染色体以外
都可在宿主细胞内表达基因产物蛋白质，而达到治疗作用
（3）分类
根据治疗的靶细胞不同
生殖细胞治疗
体细胞治疗
由于生殖细胞基因治疗涉及伦理及遗传等诸多问题，目前人类基因治疗研究与应用的重点是体细胞治疗。
一、基因治疗的基本策略主要围绕致病基因
概述
（1）指将目的基因导入靶细胞，使之成为宿主细胞遗传物质一部分，目的基因的表达产物对疾病起到治疗的作用
根据不同疾病的发病机制，所采用的基因治疗方式也有所不同
（2）随着基因治疗研究的不断深入
绝大部分疾病的发生都受到遗传因素的影响，如果用正常的健康基因替代有缺陷的基因来治疗疾病，则为这些疾病的病人提供了一个全新的治疗模式
将外源性正常基因导入病变细胞，产生正常基因表达产物来补充缺失或功能异常的蛋白质
采用适当的技术抑制过表达基因
将特定基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物
向肿瘤细胞等功能异常细胞中导入本不存在的基因，利用表达产物来治疗疾病
（一）缺陷基因精确的原位修复是基因治疗的理想方法
均是对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏基因组结构，又可达到治疗疾病目的
是最为理想的治疗方法但目前尚未能从理论和技术上得到突破。
（1）基因矫正
对致病基因的突变碱基进行纠正
（2）基因置换
用正常基因通过重组原位替换致病基因
（二）基因增补是目前临床上使用的主要基因治疗策略
（1）定义
对基因进行异位替代的方法称为基因添加或基因增补
是目前临床上使用的主要基因治疗策略。
原理：不删除突变致病基因，而在基因组某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的
（2）基因增补应用
由于目前尚无法做到基因在基因组中的准确定位插入，因此增补基因的整合位置是随机的。这种整合可能会导致基因组正常调节结构的改变，甚至可能导致新的疾病。2004年，法国一儿童医院接受基因治疗的17名严重联合免疫缺陷症病人中，有3人因逆转录病毒载体插入并激活LMO-2基因而罹患白血病。
可用于替代突变基因
例如在血友病病人体内导入凝血因子Ⅸ基因，恢复其凝血功能
可在原有基因表达水平不足以满足机体需要情况下，异位过表达来增强体内某些功能
例如将编码干扰素和白介素-2等分子的基因导入恶性肿瘤病人体内，可以激活体内免疫细胞的活力
为抗肿瘤治疗中的辅助治疗，也称为基因免疫治疗。
（三）基因治疗可采用基因沉默或失活
有些疾病是由于某一或某些基因过度表达引起的，向病人体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，可降解相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的
称为基因失活或基因沉默，也称基因干预
需要抑制的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是病毒复制周期中的关键基因
（四）自杀基因亦可应用于基因治疗
原理
将编码某些特殊酶类的基因导入肿瘤细胞
其编码的酶使无毒或低毒药物前体转化为细胞毒性代谢物
诱导细胞产生“自杀”效应，从而清除肿瘤细胞
利用肿瘤细胞特异性启动子序列以激活抑癌基因、毒蛋白基因等“细胞毒性基因”
（如肝癌的甲胎蛋白启动子序列）
通过特殊外源基因在肿瘤细胞中特异性表达以达到对肿瘤细胞的杀伤作用
二、基因治疗的基本程序
概述
基因治疗的基本过程
选择治疗基因
选择携带治疗基因的载体
选择基因治疗的靶细胞
在细胞和整体水平导入治疗基因
治疗基因表达的检测
（一）选择治疗基因是基因治疗的关键
细胞内基因在理论上均可作为基因治疗的选择目标
简言之，只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么，就可用其对应的正常基因或经改造的基因作为治疗基因。
分泌性蛋白质，如生长因子多肽类激素、细胞因子、可溶性受体（人工构建的去除膜结合特征的受体）
非分泌性蛋白质，如受体、酶、转录因子的正常基因
都可作治疗基因
（二）治疗基因的载体可携带基因进入靶细胞
概述
目前使用基因治疗用载体
大分子DNA不能主动进入细胞，即使进入也将被细胞内的核酸酶水解。因此选定治疗基因后，需要适当的基因工程载体（见第二十三章）将治疗基因导入细胞内并表达。
（1）病毒载体（临床实施一般多选用病毒载体）
野生型病毒必须经过改造，以确保其在人体内安全后才能作为基因治疗的载体
基因组结构
编码区主要为衣壳蛋白、酶和调控蛋白编码
非编码区中则含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件
病毒载体改造
剔除其复制必需的基因和致病基因，消除其感染和致病能力
原有的病毒复制和包装等功能改由包装细胞（ packaging cell）提供。包装细胞是经过特殊改造的细胞，已经转染和整合了病毒复制和包装所需要的辅助病毒基因组，可以完成病毒的复制和包装。在实际应用中，治疗用病毒载体需要先导入体外培养的包装细胞在其中进行复制并包装成新的病毒颗粒，获得足量的重组病毒后再用于基因治疗。
用作基因转移载体的病毒
不同类型的病毒载体在应用中具有不同的优势和缺点，可依据基因转移和表达的不同要求加以选择。以下仅以最为常用的逆转录病毒和腺病毒载体为例予以说明。
逆转录病毒
腺病毒
腺相关病毒（AAV）
单纯疱疹病毒（HSV）等
（2）非病毒载体
1.逆转录病毒载体
（1）逆转录病毒属于RNA病毒，其基因组中有编码逆转录酶和整合酶的基因
感染细胞内病毒基因组RNA被逆转录成双链DNA
随机整合在宿主细胞的染色体DNA上
因此可长期存在于宿主细胞基因组中，这是逆转录病毒作为载体区别于其他病毒载体的最主要优势
将逆转录病毒复制所需基因除去，代之以治疗基因，即可构建成重组的逆转录病毒载体
在目前的基因治疗中，70％以上应用的是逆转录病毒载体。
（2）优点
基因转移效率高
细胞宿主范围较广泛
DNA整合效率高
（3）缺点
病人体内万一有逆转录病毒感染，又在体内注射了大剂量假病毒后，就会重组产生有感染性病毒的可能
增加了肿瘤发生机会
由于逆转录病毒在靶细胞基因组上随机整合所致，这种整合可能激活原癌基因或者破坏抑癌基因正常表达
2.腺病毒载体
（1）腺病毒是一种无包膜大分子双链DNA病毒，可引起人上呼吸道和眼部上皮细胞的感染
人腺病毒共包含50多个血清型，其中C亚类的2型和5型腺病毒（Ad 2和Ad 5）在人体内为非致病病毒，适合作为基因治疗用载体。
（2）优点
不会整合到染色体基因组，因此不会引起病人染色体结构的破坏，安全性高
对DNA包被量大、基因转染效率高
对静止或慢分裂细胞都具有感染作用，故可用细胞范围广
（3）缺点
基因组较大，载体构建过程较复杂
治疗基因不整合到染色体基因组，故易随着细胞分裂或死亡而丢失，不能长期表达
病毒免疫原性较强，注射到机体后很快会被机体免疫系统排斥
（三）选择基因治疗的靶细胞通常是体细胞
概述
靶细胞通常是体细胞，包括病变组织细胞或正常的免疫功能细胞，靶细胞特点
由于人类生殖生物学极其复杂，主要机制尚未阐明，因此基因治疗的原则是仅限于患病的个体，而不能涉及下一代，为此国际上严格限制用人生殖细胞（germ line cell）进行基因治疗实验。 人类的体细胞有200多种，目前还不能对大多数体细胞进行体外培养，因此能用于基因治疗的体细胞十分有限。目前能成功用于基因治疗的靶细胞主要有造血干细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肌细胞和肿瘤细胞等。 此外，也可研究采用骨髓基质细胞、角质细胞、胶质细胞、心肌细胞及脾细胞作为靶细胞但由于受到取材及导入外源基因困难等因素影响，还仅限于实验研究。
靶细胞要易于从人体内获取，生命周期较长，以延长基因治疗的效应
应易于在体外培养及易受外源性遗传物质转化
离体细胞经转染和培养后回植体内易成活
最好具有组织特异性，或治疗基因在某种组织细胞中表达后能够以分泌小泡等形式进入靶细胞
1.造血干细胞
（1）造血干细胞（HSC），骨髓中具有高度自我更新能力的细胞
能进一步分化为其他血细胞
能保持基因组DNA的稳定
（2）HSC已成为基因治疗最有前途的靶细胞之一
造血干细胞在骨髓中含量很低，难以获得足够的数量用于基因治疗
人脐带血细胞是造血干细胞的丰富来源
其在体外增殖能力强，移植后抗宿主反应发生率低，是替代骨髓造血干细胞的理想靶细胞。目前已有脐带血基因治疗的成功病例。
2.淋巴细胞
（1）淋巴细胞特点
参与机体免疫反应
有较长的寿命
容易从血液中分离和回输
对目前常用基因转移方法都有一定的敏感性
适合作为基因治疗的靶细胞
（2）目前进展
已将一些细胞因子、功能蛋白的编码基因导入外周血淋巴细胞并获得稳定高效的表达
应用于黑色素瘤、免疫缺陷性疾病、血液系统单基因遗传病的基因治疗
3.皮肤成纤维细胞
皮肤成纤维细胞具有易采集、可在体外扩增培养易于移植等优点，是基因治疗有发展前途的靶细胞
逆转录病毒载体能高效感染原代培养的成纤维细胞
将它再移植回受体动物时，治疗基因可以稳定表达一段时间
通过血液循环将表达的蛋白质送到其他组织
4.肌细胞
骨骼肌细胞是基因治疗的很好靶细胞
（1）特殊T管系统与细胞外直接相通，利于注射的质粒DNA经内吞作用进入
（2）溶酶体和DNA酶含量很低，环状质粒在胞质中存在而不整合入基因组DNA，能在肌细胞内较长时间保留
将裸露的质粒DNA注射入肌组织，重组在质粒上的基因可表达几个月甚至1年之久。
5.肿瘤细胞
肿瘤细胞是肿瘤基因治疗中极为重要的靶细胞
分裂旺盛，对大多数的基因转移方法都比较敏感，可进行高效的外源性基因转移
肿瘤细胞是首选靶细胞
（四）将治疗基因导入人体有生物学和非生物学法
（1）体内基因递送方式
间接体内疗法（类似于自体组织细胞移植）
将需要接受基因的靶细胞从体内取出，在体外培养
将携带有治疗基因的载体导入细胞内
筛选出接受了治疗基因的细胞
繁殖扩大后再回输体内，使治疗基因在体内表达相应产物
直接体内疗法
将外源基因直接注入体内有关的组织器官，使其进入相应细胞并进行表达
（2）基因导入细胞方法
生物学方法
指的是病毒载体所介导的基因导入，是通过病毒感染细胞实现的
基因转移效率高
但安全问题需要重视
非生物学法
用物理或化学法，将治疗基因表达载体导入细胞内或直接导人体内
转移效率低
操作简单安全
（3）受体介导的基因转移（能够实现靶向性）
利用细胞表面受体能特异性识别相应配体并将其内吞的机制，将外源基因与配体结合后转移至特定类型细胞
无论是遗传性疾病还是恶性肿瘤的基因治疗，靶向性是非常重要的，特别是应用到体内时，既要考虑对靶细胞的治疗，又要注意对正常细胞的保护。受体介导的基因转移在基因治疗中有较好的优势和发展前景。
（五）治疗基因表达的检测方法较多
（1）被导入基因表达状态可以用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及 ELISA等方法去检测
无论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表达。
（2）导入基因是否整合到基因组以及整合部位，可以用核酸杂交技术进行分析
三、基因治疗的医学应用
概述
遗传病基本特征是由遗传基因改变所引起的
基因治疗作为一门新兴学科，在很短的时间内就从实验室过渡到临床，已被批准的基因治疗方案有两百种以上，包括肿瘤、艾滋病、遗传病和其他疾病等。 在我国，血管内皮生长因子（ vascular endo thelial growth factor，VEGF）、血友病Ⅸ因子、抑癌基因TP53等基因治疗的临床方案已进入市场或临床试验。
（1）只受一对等位基因影响的单基因遗传病，设计治疗方案相对容易
例如镰状细胞贫血、α-地中海贫血、血友病等
（2）多个基因相互作用，并受环境因素影响的疾病，治疗效果还有待基础研究的突破
高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等
1.单基因遗传病的基因治疗
（1）特点
单基因缺陷引起的遗传病，致病基因比较清楚，基因治疗方案也相对容易确定
（2）基本方案
通过一定方法把正常基因导入到病人体内，表达出正常功能蛋白
例如将人Ⅸ因子基因与逆转录病毒载体重组后转移到血友病病人自体的皮肤成纤维细胞中
使病人血中Ⅸ因子浓度升高，出血症状及出血次数都明显减少
2.针对多基因病的基因治疗
（1）恶性肿瘤的基因治疗包括
基因治疗最早是针对一些单基因遗传病进行的，但是随着人类对其他疾病分子机制的深入了解、对许多疾病相关基因的分离和功能的研究，人们逐渐将基因治疗的策略用于如恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病及艾滋病等，尤其是对恶性肿瘤的基因治疗寄予极大的希望。目前已被克隆的恶性肿瘤相关基因很多，动物模型比较成熟，病人及亲属易接受，所以，恶性肿瘤的基因治疗研究日趋活跃，并取得了显著的成果。到目前为止世界各国已经批准开展进行的基因治疗方案中，70％以上是针对恶性肿瘤的。
针对癌基因表达的各种基因沉默
针对抑癌基因的基因增补
针对肿瘤免疫反应的细胞因子基因导入
针对肿瘤血管生成的基因失活等
（2）其他基因治疗方案包括
利用过表达VEGF基因促进血管生成治疗冠心病
针对病毒复制基因的基因沉默治疗艾滋病等
四、基因治疗的前景与问题
（1）基因治疗亟待解决问题包括
经过20多年的努力，科学家们在基因治疗领域取得了很大的进步获得了一些成功
缺乏高效、靶向性的基因转移系统
对于多种疾病的相关基因认识有限，因而缺乏切实有效的治疗靶基因
对真核生物基因表达调控机制理解有限
因此对治疗基因的表达还无法做到精确调控，也无法保证其安全性
缺乏准确的疗效评价
目前的基因治疗临床试验中，限于伦理问题，多选择常规治疗失败或晚期肿瘤病人，尚难以客观地评价治疗效果。
（2）将基因治疗方案用于人体必须经过严格审批程序，需要专门机构审批与监督
1999年6月颁布的《人基因治疗申报临床试验指导原则》详细规定了基因治疗所用生物制剂的研制、生产工艺、制剂的质量控制、临床实验和临床疗效评价的各个环节中应该遵守的原则。所有基因治疗的临床使用必须严格遵守这些法律法规。 近年来国家对基因诊断与基因治疗领域非常重视，虽然没有新出台专门的规范性文件法规，但在国家大的规划方面均有涉及。在《“十三五”卫生与健康规划》（国发[2016]77号）中提出在加强行业规范的基础上，推动基因检测、细胞治疗等新技术的发展。在《“十三五”国家战略性新兴产业发展规划》（国发〔2016］67号）中提出发展专业化诊疗机构，培育符合规范的液体活检、基因诊断等新型技术诊疗服务机构。推动基因检测和诊断等新兴技术在各领域应用转化。建立具有自主知识产权的基因编辑技术体系，开发针对重大遗传性疾病感染性疾病、恶性肿瘤等的基因治疗新技术。在《“十三五”国家科技创新规划》（国发[2016］43号）中提出开展重大疫苗、抗体研制、免疫治疗、基因治疗、细胞治疗、干细胞与再生医学、人体微生物组解析及调控等关键技术研究，研发一批创新医药生物制品，构建具有国际竞争力的医药生物技术产业体系。在《中国防治慢性病中长期规划（2017—2025年）》（国办发[2017］12号）提出支持基因检测等新技术、新产品在慢性病防治领域推广应用。
在我国任何基因治疗方案都要经国家食品药品监督管理局审批