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常用分子生物学技术的原理及其应用
生物化学与分子生物学之常用分子生物学技术的原理及其应用笔记，包括分子杂交和印迹技术、PCR技术的原理与应用、生物芯片技术等等。
编辑于2022-11-02 11:58:59 广东- 常用分子生物学技术的原理及其应用
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常用分子生物学技术的原理及其应用
概述
分子生物学理论研究的突破与分子生物学技术的产生和发展息息相关
可以说两者是科学与技术相互促进的最好例证，即理论上的发现为新技术的产生提供思路，而新技术的产生又为证实原有理论和发展新理论提供有力工具。 了解分子生物学技术原理及其用途，对于加深理解现代分子生物学基本理论和研究现状、深入认识疾病发生和发展机制、理解和应用新的基于分子生物学而发展起来的诊断治疗策略和药物具有极为重要的意义。为此本章概括介绍目前分子生物学中的一些常用技术及其在医学上的应用。
第一节分子杂交和印迹技术
概述
分子杂交技术利用DNA变性与复性这一基本理化性质，结合印迹技术和探针技术，可进行DNA和RNA的定性或定量分析
一、分子杂交和印迹技术的原理
（一）印迹技术
（1）定义
将载有DNA单链分子的NC膜放在核酸杂交反应溶液中，溶液中具有互补序列的DNA或RNA单链分子就可以结合到存在于NC膜上的DNA分子上
1975年，E. Southern将经琼脂糖电泳分离的DNA片段在胶中变性使其成为单链，然后将硝酸纤维素（ nitrocellulose，NC）膜平铺在胶上，膜上放置一定厚度的吸水纸巾，利用毛细作用使胶中的DNA分子转移到NC膜上，使之固相化。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。
（2）应用
广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测
除靠毛细作用将DNA转移至NC膜外，还建立了电转移印迹技术和真空吸引转移印迹技术
缩短了转移所需时间
一些新材料用于转移膜制备而改善待测分子的转移效率和样品承载能力
（二）探针技术
（1）探针
指带有放射性核素、生物素或荧光物质等可检测标志物的核酸片段
具有特定序列，能够与待测核酸片段依据碱基互补原理结合
可用于检测核酸样品中存在的特定核酸分子
既可以是人工合成的寡核苷酸片段，也可以是基因组DNA片段、DNA全长或片段、RNA片段
（2）应用
NC膜杂交反应中，标记探针的序列如果与NC膜上的核酸存在碱基序列互补
就可以结合到膜上相应DNA或RNA区带
经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有互补序列的核酸分子存在
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹
（1）定义
印迹（ DNA blotting）为E. Southern首次应用，因而命名为 Southern blotting。
DNA样品经限制性内切酶消化后行琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段
将含有不同大小DNA片段凝胶在变性溶液中处理
将胶中的变性DNA分子转移到NC膜上
将含DNA片段的NC膜在80℃真空条件下加热或在紫外交联仪内处理
使DNA固定于NC膜上即可用于杂交反应
（2）应用
基因组DNA的定性和定量分析
对基因组中特异基因的定位及检测
基因组中转基因和基因剔除的分析
分析重组构建的质粒和噬菌体
（二）RNA印迹
（1）定义
与DNA印迹相似技术来分析RNA就称为RNA印迹，技术原理与DNA印迹相同
相对于 Southern blotting，有人将RNA印迹称为 Northern blotting
（2）特点
RNA分子较小，转移前无需进行限制性内切酶切割，而且变性RNA的转移效率也比较高
（3）应用
检测特定组织或细胞中已知的特异mRNA和非编码RNA的表达水平
尽管用RNA印迹技术检测RNA的敏感性较PCR法（见本章第二节）低，但是由于其特异性强，假阳性率低，仍然被认为是最可靠的mRNA和非编码RNA定量分析方法之一。
比较不同组织和细胞中同一基因的表达情况
（三）蛋白质印迹
（1）定义
蛋白质在电泳之后从胶中转移并固定到膜型材料上，再依靠与溶液中相应的蛋白质分子相互结合来进行定性定量分析
印迹技术不仅可用于核酸的分子杂交，而且也可用于蛋白质的分析。 相对应于DNA的 Southern blotting和RNA的 Northern blotting，蛋白质印迹被称为 Western blotting。
最常用的是用抗体来检测，亦被称为免疫印迹
（2）过程
1、转移（只有靠电转移方可实现）
先将混合蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开
再将蛋白质转移到NC膜或其他膜上
2、分析（主要靠抗体）
特异性抗体（称为第一抗体）首先与转移膜上相应的蛋白质分子结合
然后用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或放射性核素标记的第二抗体与之结合
反应之后用底物显色或放射自显影来检测蛋白质区带信号（底物亦可与化学发光剂相结合以提高敏感度）
（3）应用
检测样品中特异性蛋白质的存在
细胞中特异蛋白质的半定量分析
蛋白质分子的相互作用研究
其他方法用于核酸和蛋白质分析
斑点印迹
不经电泳分离而直接将样品点在NC膜上用于核酸杂交分析
原位杂交（ISH）
组织切片或细胞涂片可以直接用于杂交分析
DNA芯片技术
将多种已知序列DNA排列在一定大小尼龙膜或其他支持物上用于检测细胞或组织样品中的核酸种类
第二节PCR技术的原理与应用
概述
PCR技术可将微量DNA片段大量扩增，使微量DNA或RNA的操作变得简单易行
20世纪70年代末，随着DNA重组技术的产生和发展，如何快速获得目的基因（待检测或待研究的特定基因）片段已经成为瓶颈问题。1983年K. Mullis发明了合酶链反应（ chain reaction，PCR）技术。 许多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展，成为分子生物学与医学的支撑技术。许多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展，成为分子生物学与医学的支撑技术。 近年来，PCR技术不断改进，从手工操作发展到自动化仪器，从定性分析发展到定量测定。该方法与其他分子生物学技术相结合，其用途日益广泛。新的PCR技术类型层出不穷。
高敏感
高特异
可重复
快速简便
一、PCR技术的工作原理
（1）基本工作原理
在体外模拟体内DNA复制的过程
以待扩增的DNA分子为模板，用两条寡核苷酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合，提供3’-OH末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条新链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
①反应特异性依赖于与模板DNA两端互补的寡核苷酸引物
②组成PCR反应体系基本成分
模板DNA
特异引物
耐热性DNA聚合酶（如 Taq DNA聚合酶）
dNTP
含有Mg2+的缓冲液
（2）基本反应步骤
变性
将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除
退火
将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5℃），使引物与模板DNA结合
延伸
将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应
3步骤1循环，新合成DNA分子继续作为下一轮合成模板，经多次循环（25～30次）后即可达到扩增DNA片段目的
二、PCR技术的主要用途
（一）获得目的基因片段
为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法
（1）人类基因组计划完成之前，PCR是从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似新基因片段或新基因的主要方法
（2）目前是从各种生物标本或基因工程载体中快速获得已知序列目的基因片段的主要方法
（二）DNA和RNA的微量分析
PCR技术（敏感性高，对模板DNA量要求很低）是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法
理论上讲，只要存在1分子的模板，就可以获得目的片段。实际工作中，1滴血液、1根毛发或1个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
（三）DNA序列分析
引入DNA序列测定，使测序简化，提高测序速度，是实现高通量DNA序列分析的基础
待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定
（四）基因突变分析
PCR与其他技术结合可以大大提高基因突变检测的敏感性
单链构象多态性分析
等位基因特异的寡核苷酸探针分析
基因芯片技术
DNA序列分析等
（五）基因的体外突变
利用PCR技术随意设计引物在体外对目的基因片段进行插入嵌和、缺失、点突变等改造
在PCR技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一项费时费力的工作。
三、几种重要的PCR衍生技术
PCR技术自身的发展及其与已有分子生物学技术的结合形成了多种PCR衍生技术，提高了PCR反应的特异性和应用的广泛性。本章仅举例介绍部分与医学研究密切相关的PCR衍生技术。
（一）逆转录PCR技术
逆转录PCR(RT-PCR）是将RNA逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术
以RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA
再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因
RT-PCR可检测到单个细胞中少于10个拷贝的特异的RNA
目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性和半定量分析的最有效方法，也是最广泛使用的PCR方法
（二）原位PCR技术
原位PCR是利用完整细胞作为一个微小反应体系来扩增细胞内的目的基因片段
特点
反应在甲醛溶液（福尔马林）固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上单个细胞内进行
反应后再用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在
原位PCR弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足
由于常规PCR或RT-PCR技术的产物不能在组织细胞中直接定位，因而不能与特定的组织细胞特征表型相联系，而原位杂交技术虽有良好的定位效果，但灵敏度不高。 原位PCR在分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程有重大的实用价值。
将目的基因的扩增与定位相结合
既能分辩鉴定带有靶序列的细胞
又能标出靶序列在细胞内的位置
（三）实时PCR技术
概述
常规PCR反应
在反应终点检测产物含量
在反应过程中产物以指数形式增加
多次循环反应后产物堆积将影响对原有模板含量差异的准确判断
常规PCR反应只能作为半定量手段
实时PCR技术（定量PCR）
通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰
实现了mRNA、 miRNA及其他非编码RNA快速而准确的定量分析
已在临床应用于基因诊断
1.实时PCR的基本技术原理
（1）基本原理
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程
故也被称为实时荧光定量PCR或荧光定量PCR
（2）方法
①采用专用PCR仪，自动在每个循环特定阶段对反应体系荧光强度进行采集，实时记录荧光强度改变
PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线
②利用荧光信号实时监测和计算，可以准确确定起始DNA拷贝数
由于反应起始的模板DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系
从而对样品浓度进行精确定量
2.实时PCR技术的分类
荧光标记是实现PCR反应实时定量的化学基础
实时荧光定量PCR的化学原理包括引物探针类和非引物探针类两种
（1）非引物探针类实时PCR
利用非特异性插入双链DNA的荧光染料来指示扩增的增加
非引物探针类实时PCR加入的是能与双链DNA结合的荧光染料，由此来实现对PCR过程中产物量的全程监测，并不使用荧光来标记引物
最常用的是能结合到DNA双螺旋小沟区域的荧光染料 SYBR Green
该染料处游离状态时，荧光信号强度较低，一旦与双链DNA结合之后，荧光信号强度大大增强（约为游离状态的1000倍）。荧光信号的强度与反应体系中的双链DNA（代表合成产物）的量成正比（图24-3）因此，该荧光染料可用来实时监测PCR产物量的多少。由于非探针类实时PCR成本低廉，便易行，近年来得到很快的发展，技术日趋完善，从而在基因表达的定量分析方面广泛应用。
（2）引物探针类实时PCR
利用可与靶DNA序列特异杂交结合的引物，标记荧光报告基团作为探针，来指示扩增产物的增加
通过使用荧光标记的引物为探针来产生荧光信号
探针除了能产生荧光信号用于监测PCR进程之外，还能和模板DNA待扩增区域结合，因此提高了PCR的特异性，目前常用的探针类实时PCR包括 TaqMan探针法、分子信标（ molecular beacons）探针法和荧光共振能量转移（ fluorescence resonance energy transfer，FRET）探针法等。荧光探针由于增加了探针的互补识别步骤，特异性更高，且可采用多色荧光探针，可在一个反应中实现对数种不同基因表达水平的同时检测。
3.实时PCR的应用
实时定量PCR技术具有定量、特异、灵敏和快速等特点，是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法，是DNA定量技术的一次飞跃。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。这些应用将改变以往对疾病的表型认识和表型诊断，而是从本质上认识疾病和诊断疾病。
（1）实时PCR在肿瘤领域的应用
可用于肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期、治疗及预后评估
①有效地检测基因的突变、重排、易位等
实时荧光定量PCR可运用特异性荧光探针检测基因突变。可设计跨越疑似突变位点的荧光探针，进行基因扩增，然后对扩增产物进行缓慢加热获得熔解曲线，根据熔解曲线特征判断有无突变。也可使用双色标记探针进行突变检测，一个检测野生型，另一个标记的探针检测突变体。
②准确检测癌基因表达量
（2）实时PCR用于多态性分析
在单核苷酸多态性（SNP）分析方面有很好应用前景
例如用于预测药物在同一疾病不同个体内的效应差异所致的治疗反应性不同，按照基因多态性的特点用药，将会使临床治疗符合个体化的要求。
（3）实时PCR用于病原体的检测
用于多种细菌、病毒、支原体、衣原体的检测
例如，实时定量PCR不仅能对病毒定性，而且由于其实验批间和批内差异小，重复性好，因此能方便、快速、灵敏、准确地定量其DNA或RNA的序列，动态观测病程中潜在病毒数量
如实时定量PCR可准确检测标本中HBV拷贝数，实时监测病人治疗效果和临床状态
如对乙型肝炎病毒HBV的检测。以往对乙肝病毒的检测主要依靠乙肝表面抗原（ HBsAg）这种间接指标，然而HBsAg阳性或阴性很难判断病人体内的HBV是否处丁复制期，病毒复制的量又如何，以及病人是否具有传染性。
第三节DNA测序技术
概述
（1）测序目的是确定一段DNA分子中4种碱基（A、G、C、T）排列顺序
分子生物学发展的初期，采用部分酶解等方法仅能测定RNA的序列，且费时费力。1977年， Maxam AM和 GilbertW合作创立了化学降解法，又称 Maxam-Gilbert测序法；同年， SangerF创建了双脱氧测序法或称 Sanger法。这两种方法的建立实现了DNA测序技术的第一次飞跃，三位科学家也因此分享了1980年的诺贝尔化学奖。40余年来，DNA测序技术发展迅速，从手工操作到自动化仪器分析、从单一短片段到高通量平行分析，尤其是在人类基因组计划的推进和带动下，已经实现了高速和低价的目标，人全基因组30亿碱基对的测序目前已经成为常规技术。快速测序技术极大推动了生物学和医学多个领域的理论突破和应用研究。
（2）DNA测序技术是阐明和理解基因结构、基因功能、基因变异、基因表达调控的基础
也是实现在分子层次预测、预防、诊断和治疗疾病的个体化医学最重要支撑技术
一、双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法
早期的DNA测序只能在实验室内手工完成，故基本上是用于分子生物学研究工作，采用的是双脱氧法或化学降解法。
（一）双脱氧法DNA测序技术
（1）定义
Sanger双脱氧测序法亦称为链终止法，基于对引物的延伸合成反应
用DNA聚合酶来延伸结合在待测序列DNA模板上的寡脱氧核苷酸引物，直到在新合成的DNA链的3’-末端掺入了种放射性核素标记的2’，3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）底物的其中一种。由于 ddNTP脱氧核糖的3’-位碳原子上缺少羟基而不能与下一位核苷酸的5’-位磷酸基之间形成3’，5’-磷酸二酯键，从而使得正在延伸的DNA链在该ddNTP处终止。
（2）原理
4种不同反应体系中分别加入4种不同ddNTP底物（A、G、C、T）
可得到终止于相应特定碱基的一系列不同长度DNA片段
①具有共同的起点（即引物的5’-末端），而有不同的终点（即ddNTP掺入的位置）
②长度取决于 ddNTP掺入的位置与引物5’-末端之间的距离
经可分辨1个核苷酸差别的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段
再借助片段的放射性核素或荧光标记，即可读出一段DNA序列
（二）化学降解法DNA测序技术
这一方法的建立在分子生物学发展早期发挥了重要作用，但因其费用高且难以实现自动化而被其他方法取代。
Maxam-Gilbert化学降解测序法首先对待测序DNA片段末端进行放射性核素标记
用专一性化学试剂将该片段DNA进行特异性降解
产生4套含有长短不一DNA片段的混合物
再通过其所带的标记读出序列
二、第一代全自动激光荧光DNA测序仪器基于双脱氧法
（1）Sanger方法和 Maxam-Gilbert化学降解法
手工操作对技术人员的经验和技术熟练程度要求很高
实验失败概率高
难以在普通实验室推广普及
难以满足分子生物学的迅速发展及其在医学等领域应用的需求
催生了自动化分析仪的发明
（2）早期全自动DNA序列分析仪工作原理主要基于 Sanger法，采用四色荧光标记ddNTP而制作
在四色荧光法分析中，采用4种不同荧光染料标记4种不同的可终止DNA延伸反应的底物 ddNTP，经 Sanger法反应后，赋予所合成的DNA片段种不同的颜色待测DNA样品的4个反应产物在同一个泳道内依照片段大小电泳分离，由仪器自动连续采集荧光数据并完成分析，最后直接显示待测DNA的碱基序列。
（3）目前自动激光荧光DNA测序仪（第一代测序仪）应用已十分普遍，可实现制胶、进样、电泳、检测、数据分析全自动化
第一代测序技术的读长可以超过1000bp，原始数据的准确率可高达99.999％
（4）人类基因组计划的第一个人类基因组草图的绘制采用的就是 Sanger法
美国英国、日本、法国、德国、加拿大、中国等7个国家的科学家合作，用了众多自动激光荧光DNA测序仪，以集成式工厂化运行模式而完成的。
三、高通量DNA测序技术使基因测序走向医学实用
（1）新一代测序（NGS），先后有第二代、第三代甚至第四代之分
要将人类基因组序列分析的研究成果用于各种复杂疾病的机制研究、诊断、预警、治疗监测以及法医学鉴定等医学实践，需要对人群及个体进行全基因组序列分析。为此必须首先实现DNA测序技术的微量、快速和低成本化，而标准的 Sanger法及第一代测序仪的高成本很难满足这一需求，新的高通量DNA测序技术及其分析仪器因此应运而生。
共同特点都是实现了微量化、高通量并行化和低成本
（2）所有的NGS都是在一次反应中同时分析多个DNA小片段
在超高通量测序时，甚至可并行百万个测序反应。需要指出的是，每一种新的高通量测序技术都是伴随相应的新仪器而诞生的，否则无法进入生物学和医学领域。
可快速获得所有序列，再经生物信息学整合分析，得出个体基因组序列
（3）一些NGS技术需要首先进行待测DNA片段的PCR扩增
这些技术和仪器主要包括
454基因组测序仪利用焦磷酸测序，检测DNA合成产生的焦磷酸。综合运用了乳液PCR、微流控芯片、焦磷酸检测等技术。
Solexa/ Illumina测序仪检测DNA合成反应中掺入的荧光标记单核苷酸，利用桥式PCR、微流控芯片、荧光标记基团和终止基团检测等技术
SOLiD测序仪基于寡核苷酸连接反应，利用乳液PCR、微流控芯片，检测DNA连接酶催化的荧光标记寡核苷酸探针连接到DNA链过程中释放出的光学信号
（4）第三代测序技术
无需PCR扩增反应，直接针对DNA单分子进行序列分析
HeliScope测序技术
单分子实时技术（SMRT）
基于荧光共振能量转移（FRET）的测序技术等
（5）高通量DNA测序技术意义
极大促进了人全基因组测序（WGS）、转录组测序（RNA-seq）、全外显子测序（Exome-seq）、DNA-蛋白质相互作用（染色质免疫共沉淀测序)、病原微生物全基因组测序等在医学研究和实践中的应用，为医学进入大数据时代提供了核心技术支撑
四、DNA测序在医学领域具有广泛应用价值
DNA测序技术在医学领域的使用日益广泛和深入
（1）DNA测序在医学研究和临床实践中主要用途
通过人群大样本分析
确定单基因遗传病和多基因变异相关疾病的SNP位点基因结构变异、基因拷贝数变异等
鉴定出可用于复杂性疾病易感性预警或早期诊断的疾病标志物
将单一基因或多个基因的变异检测用于临床诊断
变异的发现还将指导治疗靶点的确认和药物研发
检测肿瘤组织染色体畸变、癌基因和抑癌基因突变位点、融合基因、染色体拷贝数变化等
为肿瘤分子分型和治疗敏感性监测提供依据
进行个人基因组分析
大数据平台发展基础上，建立个人SNP位点与疾病易感性、药物敏感性和耐受性以及其他诸多表型之间的联系
用于病原微生物检测，确定病原微生物的分子分型
为抗病毒或细菌感染治疗提供依据
（2）DNA测序在法医学领域具有特殊意义
极大提高了DNA鉴定的敏感性和准确性
在各类案件中作为司法证据的重要性越加凸显
（3）在亲子鉴定中亦具有重要价值
第四节生物芯片技术
概述
生物芯片技术应用
是在20世纪末发展起来的一项新的规模化生物分子分析技术，目前已被应用于生命科学的众多领域
基因表达检测
基因突变检测
基因诊断
功能基因组研究
基因组作图等
一、基因芯片
（1）基因芯片（DNA微阵列）定义
指将许多特定DNA片段有规律紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号作出检测、比较和分析，而迅速得出定性和定量的结果
（2）特点
①可在同一时间内分析大量基因
高密度基因芯片可以在1cm²面积内排列数万个基因用于分析，实现了基因信息的大规模检测
②特别适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的基因差异表达情况
原理是基于双色荧光探针杂交
该系统将两个不同来源样品的mRNA逆转录合成cDNA时用不同的荧光分子（如正常用红色、肿瘤用绿色）进行标记（图24-5），标记的cDNA等量混合后与基因芯片进行杂交，在两组不同的激发光下检测，获得两个不同样品在芯片上的全部杂交信号。呈现绿色荧光的位点代表该基因只在肿瘤组织表达，呈现红色信号的位点代表该基因只在正常组织表达呈现两种荧光互补色——黄色的位点则表明该基因在两种组织中均有表达。
二、蛋白质芯片
（1）定义
将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白质样品反应时，可捕获样品中靶蛋白质，再经检测系统对靶蛋白质进行定性和定量分析的一种技术
（2）基本原理
蛋白质分子间的亲和反应（最常用的蛋白质探针是抗体）
例如抗原抗体或受体配体之间的特异性结合
在用蛋白质芯片检测时，首先要将样品中的蛋白质标记上荧光分子，经过标记的蛋白质一旦结合到芯片上就会产生特定的信号，通过激光扫描系统来检测信号。
（3）特点
快速和高通量等
它可以对整个基因组水平的上千种蛋白质同时进行分析，是蛋白质组学研究的重要手段之一，已广泛应用于蛋白质表达谱蛋白质功能蛋白质间的相互作用的研究。在临床疾病的诊断和新药开发的筛选上也有很大的应用潜力。
第五节蛋白质的分离、纯化与结构分析
概述
（1）蛋白质是生物大分子，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点
人体的细胞和体液中存在成千上万种蛋白质，要分析其中某种蛋白质的结构和功能，需要从混合物分离纯化出单一蛋白质。
（2）蛋白质分离通常是利用其特殊理化性质，采取盐析、透析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法，以满足研究蛋白质结构与功能的需要
一、蛋白质沉淀用于蛋白质浓缩及分离
蛋白质在溶液中一般含量较低，需要经沉淀浓缩，以利于进一步分离纯化。
1.有机溶剂沉淀蛋白质
丙酮、乙醇等有机溶剂可使蛋白质沉淀，再将其溶解在小体积溶剂中获得浓缩蛋白质溶液
为保持蛋白质结构和生物活性，需在0～4℃低温下进行丙酮或乙醇沉淀，沉淀后应立即分离，否则蛋白质会发生变性
2.盐析分离蛋白质
盐析是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀
各种蛋白质盐析时所需盐浓度及pH均不同，可据此将不同蛋白质予以分离
所以盐析法可将蛋白质初步分离，但欲得纯品，尚需用其他方法。许多蛋白质经纯化后，在盐溶液中长期放置逐渐析出，成为整齐的结晶。
例如血清中
清蛋白可溶于pH7.0左右的半饱和硫酸铵溶液中
硫酸铵溶液达到饱和时，清蛋白也随之析出
球蛋白在pH7.0左右半饱和硫酸铵溶液中发生沉淀
3.免疫沉淀分离蛋白质
利用特异抗体识别相应抗原并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白
这就是可用于特定蛋白质定性和定量分析的免疫沉淀法。在具体实验中，常将抗体交联至固相化的琼脂糖珠上，易于获得抗原抗体复合物。进一步将抗原抗体复合物溶于含十二烷基硫酸钠和二巯基丙醇的缓冲液后加热，使抗原从抗原抗体复合物分离而得以纯化，并用于分析。
蛋白质具有抗原性，将某种纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白质的特异抗体
二、透析和超滤法去除蛋白质溶液中的小分子化合物
（1）透析法
利用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法
透析袋是用具有超小微孔的膜，如硝酸纤维素膜制成，一般只允许分子量为10kD以下的化合物通过
将蛋白质溶液装在透析袋内，置于水中，硫酸铵、氯化钠等小分子物质可透过薄膜进入水溶液，由此可对盐析浓缩后的蛋白质溶液进行除盐。如果透析袋外放放置吸水剂如聚乙二醇，则袋内水分伴同小分子物质透出袋外，高分子量的蛋白质留在袋内，可达到浓缩目的。
（2）超滤法
应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜达到浓缩蛋白质溶液的目的
简便、回收率高，是常用的浓缩蛋白质溶液方法
三、电泳分离蛋白质
概述
电泳
通过蛋白质在电场中泳动（蛋白质在高于或低于其pI溶液中成为带电颗粒，在电场中能向正极或负极方向移动）而达到分离各种蛋白质的技术
根据支撑物的不同，有纤维薄膜电泳、凝胶电泳等。
薄膜电泳
将蛋白质溶液点样于薄膜上，薄膜两端分别加正、负电极
带正电荷的蛋白质向负极泳动
带负电荷的蛋白质向正极泳动
带电多，分子量小的蛋白质泳动速率快
带电少，分子量大的则泳动慢
凝胶电泳
支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶
凝胶置于玻璃板上或玻璃管中，凝胶两端分别加上正、负电极，蛋白质混合液即在凝胶中泳动
电泳结束后，用蛋白质显色剂显色即可看到多条已被分离的蛋白质色带
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
若蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷较多的十二烷基硫酸钠（SDS）
使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间的电荷差异消失
此时蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关
加之聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）
2.等点聚焦电泳分离蛋白质
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入系列两性电解质载体
电场中形成一个连续而稳定的线性pH梯度（即pH从凝胶正极向负极依次递增）
这种介质中电泳时，被分离蛋白质处在偏离其等电点的pH位置时带有电荷而移动
当蛋白质泳动至与其自身pI值相等pH区域时，其净电荷为零而不再移动
通过蛋白质等电点差异而分离蛋白质的电泳方法称为等电聚焦电泳（IEE）
3.双向凝胶电泳分离蛋白质
利用被分离蛋白质等电点和分子量的差异，将复杂蛋白质混合物在二维平面上分离
人类基因组计划完成后迎来了后基因组时代，其中蛋白质组学的研究颇受重视。双向凝胶电泳（2-DE）是蛋白质组学研究的重要技术之一。
第一向是蛋白质的IEE
第二向为SDS-PAGE
四、层析分离蛋白质
层析原理
待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的
层析是分离、纯化蛋白质的重要手段之一。
（1）离子交换层析（应用广）
图24-6介绍的是阴离子交换层析，将阴离子交换树脂颗粒填充在层析管内，由于阴离子交换树脂颗粒上带正电荷，能吸引溶液中的阴离子（图24-6a）。然后再用含阴离子（如Cl-）的溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来（图24-6b）；增加Cl-浓度，含负电量多的蛋白质也被洗脱下来（图24-6c），于是两种蛋白质被分开。
蛋白质、氨基酸是两性电解质，在某一特定pH时，蛋白质的电荷量及性质不同
（2）凝胶过滤（应用广），又称分子筛层析
层析柱内填满带有小孔的颗粒（一般由葡聚糖制成）。蛋白质溶液加于顶部，任其渗漏
小分子蛋白质进入孔内，在柱中滞留时间较长
大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出
不同大小蛋白质得以分离
（3）亲和层析
五、蛋白质颗粒沉降行为与超速离心分离
超速离心法既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量
蛋白质在高达500000g（g为 gravity，地心引力单位）的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力（buoyant force）与离心所产生的力相等，此时沉降停止。不同蛋白质其密度与形态各不相同，因此用上述方法可将它们分开。
蛋白质在离心力场中的沉降行为用沉降系数（S）表示（与蛋白质的密度和形状相关)
六、蛋白质的一级结构分析
F. Sanger耗时多年才在1953年基本完成了胰岛素的一级结构测定，现今由于方法学改进及自动化分析仪器的产生，已有越来越多蛋白质的氨基酸序列问世。 近年来，由于核酸研究在理论上及技术上的迅猛发展，尤其是人全基因组测序的完成，各种蛋白质的氨基酸序列已经可以通过核酸序列来推演。然而，蛋白质组学研究、生物制药产品的鉴定等仍需要进行高效而准确的蛋白质的部分一级结构分析。
1.离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分
分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成
蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数
2.测定多肽链的氨基端和羧基端的氨基酸残基
测定多肽链的氨基端与羧基端为何种氨基酸残基
F. Sanger最初用二硝基氟苯与多肽链的氨基作用生成二硝基苯氨基酸，然后将多肽水解，分离出带有二硝基苯基的氨基酸。
目前多用丹酰氯使之生成丹酰衍生物，该物质具强烈荧光，更易鉴别
羧基端氨基酸残基可用羧肽酶将其水解下来进行鉴定
3.肽链序列的测定
将肽链水解成片段分别进行分析
胰蛋白酶法
水解赖氨酸或精氨酸羧基所形成的肽键
如果蛋白质分子中有4个精氨酸及赖氨酸残基，则可得5个片段
胰凝乳蛋白酶法
水解芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸）羧基侧的肽键
溴化氰法
水解甲硫氨酸羧基侧肽键
蛋白质水解生成的肽段，可通过层析和电泳及质谱将其分离纯化并鉴定，得到图谱称为肽图
可明确肽段的大小和数量
各肽段的氨基酸排列顺序一般采用 Edman降解法进行分析。将待测肽段先与异硫氰酸苯酯反应，该试剂只与氨基端氨基酸的游离α-氨基作用再用冷稀酸处理，氨基端残基即自肽链脱落下来，成为异硫氰酸苯酯衍生物，用层析可鉴定为何种氨基酸衍生物。残留的肽链可继续与异硫氰酸苯酯作用依次逐个鉴定出氨基酸的排列顺序（图24-9）。对分析出的各肽段中的氨基酸顺序，进行组合排列对比，最终得出完整肽链中的氨基酸排列顺序。
七、蛋白质的空间结构分析
大量生物体内存在的蛋白质空间结构的解析，对于研究蛋白质结构与功能的内在关系至关重要，也为蛋白质或多肽药物的结构改造以致增强作用减弱副作用提供了理论依据。由于蛋白质的空间结构十分复杂，因而其测定的难度也较大，而且还需昂贵的仪器设备和先进的技术。随着结构生物学的发展，蛋白质二级结构和三维空间结构的测定也已普遍开展。
1.圆二色光谱法测定蛋白质二级结构
圆二色光谱（CD）测定溶液状态下的蛋白质二级结构
CD谱对二级结构非常敏感
α-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰等3个成分
β-折叠的CD谱不很固定
测定含α-螺旋较多的蛋白质，所得结果更准确
2.蛋白质三维空间结构解析
X射线衍射和核磁共振（NMR）技术是研究蛋白质三维空间结构的经典方法
X射线衍射法需首先将蛋白质制备成晶体，射至蛋白质晶体上，产生不同方向衍射，收集衍射光束所产生的电子密度图，可计算出空间结构
核磁共振技术主要用于测定蛋白质的液相三维空间结构
冷冻电镜技术当前已经成为结构生物学主要研究手段
极大提高了蛋白质三维结构的解析速度和分辨率
且可以分析蛋白质在相对天然状态下的结构
3.生物信息学预测蛋白质空间结构
蛋白质空间结构基础是一级结构，参照已经完成的各种蛋白质三维结构数据库，已经可以初步预测各种蛋白质的三维空间结构
第六节生物大分子相互作用研究技术
概述
（1）生物大分子间可相互作用并形成各种复合物
所有重要生命活动（DNA的复制、转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等），都由这些复合物所完成
（2）理解生命活动基本机制的基础
有关研究技术发展迅速，本节选择性介绍部分方法的原理和用途。
研究细胞内各种生物大分子相互作用方式
分析各种蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA复合物的组成和作用方式
一、蛋白质相互作用研究技术
概述
常用研究蛋白质相互作用的技术
本部分简要介绍标签蛋白（tagged protein）沉淀和酵母双杂交技术（yeast two-hybrid- system）。
酵母双杂交
各种亲和分离分析（亲和色谱、免疫共沉淀、标签蛋白沉淀等）
FRET效应分析
噬菌体显示系统筛选等
（一）标签蛋白沉淀
（1）定义及原理
一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法
利用一种带有特定标签的纯化融合蛋白作为钓饵，在体外与待检测纯化蛋白质或含有此待测蛋白质的细胞裂解液温育
然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收洗脱液经电泳分离并染色
如果两种蛋白质有直接结合，待检测蛋白质将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀，在电泳胶中见到相应条带
（2）应用
①用于证明两种蛋白质分子是否存在直接物理结合
②分析两种分子结合的具体结构部位
③筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子
④亦常用于重组融合蛋白的纯化
（3）常用标签
①谷胱甘肽S-转移酶（GST）（最常用标签）
有各种商品化的载体用于构建GST融合基因，并在大肠杆菌中表达为GST融合蛋白
利用GST与还原型谷胱甘肽（GSH）的结合作用，可以用共价偶联了GSH的琼脂糖珠进行标签蛋白沉淀实验
②6个连续排列组氨酸（6 x His）标签，可以与镍离子琼脂糖珠结合
（二）酵母双杂交技术
（1）定义
酵母双杂交技术建立基于对酵母转录激活因子GAL4分子的认识
酵母双杂交系统目前已经成为分析细胞内未知蛋白质相互作用的主要手段之一。
GAL4分子的DNA结合区（BD）和促进转录的活性区（AD）
被分开后将丧失对下游基因表达的激活作用
分别融合具有配对相互作用的两种蛋白质分子
可依靠所融合蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用
（2）应用
①证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用
②分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键氨基酸残基
③将待研究蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒
可筛选AD基因融合的“猎物”基因cDNA表达文库，获得未知的相互作用蛋白质
二、DNA蛋白质相互作用分析技术
概述
蛋白质与DNA相互作用是基因表达及其调控的基本机制
分析各种转录因子所结合特定DNA序列、基因调控序列所结合的蛋白质是阐明基因表达调控机制的主要研究内容
这里介绍两种目前常用的研究DNA与蛋白质相互作用的技术。
（一）电泳迁移率变动分析
（1）电泳迁移率变动分析（EMSA）又称凝胶迁移变动分析
最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析
已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。
（2）原理：DNA结合蛋白与特定DNA探针片段的结合会增大其分子量，在凝胶中的电泳速度慢于游离探针，即表现为条带相对滞后
在实验中预先用放射性核素或生物素标记待检测的DNA探针，再将标记好的探针与细胞核提取物温育一定时间，使其形成DNA-蛋白质复合物，然后将温育后的反应液进行非变性（不加SDS，以免形成的复合物解离）丙烯凝胶酰胺电泳，最后用放射自显影等技术显示出标记DNA探针的条带位置。
（二）染色质免疫沉淀技术
（1）染色质免疫沉淀技术（ChIP）是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法
真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的重要途径。
基本原理
活细胞状态下，用化学交联试剂固定蛋白质-DNA复合物
将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段
通过免疫学方法沉淀此复合体
再利用PCR技术特异性地富集目的蛋白质结合的DNA片段
从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息
（2）ChIP芯片（ChIP-chip）技术
在全基因组范围筛选与特定蛋白质相结合的DNA序列，即鉴定特定核蛋白的DNA结合靶点