蛋白质和氨基酸的测定

蛋白质和氨基酸的测定知识梳理，包括蛋白质的组成、蛋白质测定的意义、蛋白质测定方法、蛋白质中氮的测定方法、氨基酸态氮的测定等等。

蛋白质和氨基酸的测定

• 概述
  • 蛋白质的组成
    • 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它由20多种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有复杂的空间结构。它主要含的元素是C 、H、O、N、S、P另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。而含N是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。
  • 氨基酸
    • protein是由氨基酸组成的高分子化合物，构成protein的氨基酸主要是其中的20种。
  • 蛋白质测定的意义
    • 蛋白质是微生物发酵过程中所必需的重要氮源之一。发酵原料中蛋白质含量的高低对发酵产品的质量影响很大。啤酒生产要选用蛋白质含量较低的大麦等原料，因啤酒酿造中，原料（大麦芽）中蛋白质含量过高，可造成啤酒浑浊、高级醇含量偏高。但对酱和酱油等发酵调味品来讲，则需要选用蛋白质含量较高的原料； 至于活性干酵母，含氮量则是评价其成品质量的一个重要指标，主要是判定活性酵母菌的数量
  • 蛋白质测定方法
    • 利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽键和折射率测定蛋白质含量
    • 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。
• 蛋白质中氮的测定方法
  • 凯氏定氮法
    • 凯氏定氮法
      • 介绍
        • 凯氏（Kjeldah）定氮法是目前普遍采用的测定有机N总量较为准确、方便的方法之一，适用于所有食品。
        • 凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总N量，再换算成为蛋白质含量。食品中的含N物质，除蛋白质中的氮以外，还包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白质含N物质，所以该法测定的蛋白质含量应称为粗蛋白质。
        • 一般来说，pro的平均含氮量为16%，即1份N素相当于6.25份蛋白质，所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%乘上pro的换称参数K=6.25即为该物质的pro含量。
        • 蛋白质含N量的倒数称为蛋白质换算系数。
        • 食品种类不同，蛋白质的组成也不一样，其N量也不相同，蛋白质换算系数差别很大，如：玉米、荞麦为6.25， 花生：5.46；大米：5.95；大豆及其制品：5.71；面粉：5.70；乳制品：6.38；
        • 凯氏定氮法有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添量不同，一般采用硫酸铜、二氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜
      • 原理
        • 食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
        • 凯氏定氮法（化学）反机理
      • 概述
        • 样品消化
          • 浓硫酸具有脱水性，，有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
        • 蒸馏
          • 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气
        • 吸收与滴定
          • 加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用
      • 适用范围
        • 可以应用于各类食品蛋白质含量测定
      • 仪器
        • 500ml凯氏烧瓶
        • 定氨蒸馏装置
      • 试剂
        • 硫酸铜
        • 硫酸钾
        • 浓硫酸
        • 40g∕L硼酸溶液
        • 混合指示剂
        • 400g∕L氢氧化钠
        • 0.1mol∕L盐酸 标准溶液
      • 操作步骤
        • 样品消化
          • 准确称取均匀的固体样品0.5～3g，或半固体样品2～5g，或吸取溶液样品15～25ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化（若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽除消化过程所产生的烟气）。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h，冷却至室温
        • 蒸馏和吸收
          • 按图装好蒸馏装置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml 40g∕L硼酸溶液及混合指示剂5~6滴）。凯氏烧瓶内，加入100ml蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70ml 400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏
        • 滴定
          • 将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。
        • 结果计算
          • W—蛋白质的质量分数，%； c—盐酸标准液的浓度，mol/L； V1—空白滴定消耗标准液量，mL； V2—试剂滴定消耗标准液量，mL； m—样品质量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数。
    • 微量凯氏定氮法
      • 原理
        • 微量凯氏定氮法的原理与操作方法，与常量法基本相同，所不同的是样品质量及试剂用量较少，且有一套适于微量测定的定型仪器——微量凯氏定氮器
      • 仪器
        • 100ml凯氏烧瓶
        • 微量凯氏定氮器
      • 试剂
        • 20g/L硼酸溶液。
        • 400g/L氢氧化钠。
        • 1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5混合。
        • 0.01mol/L盐酸标准溶液
        • 其他试剂同常量法
      • 测定方法
        • 样品消化
          • 样品消化步骤常量法。将消化完全的消化液冷却后，完全转入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀
        • 蒸馏
          • 于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在接受瓶内加入10ml 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下
          • 吸取10.00ml样品消化稀释液，，由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加入400g/L氢氧化钠10ml使溶液呈强碱性，用少量蒸馏 水洗漏斗数次，盖塞 ，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛10mL4%（或2%）硼酸吸收液，蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始记时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏
        • 滴定
          • 取下接受瓶，以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。
      • 结果计算
        • W—蛋白质的质量分数，%； V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数； m—样品质量，g
    • 硫酸铜的作用
      • 催化剂
      • 指示消化终点到达
      • 碱蒸馏时作为碱性反应的指示剂
    • 硫酸钾的作用
      • 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000℃以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解 ，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾
    • 注意事项
      • 所有试剂应用无氨蒸馏水配置
      • 消化过程应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附着在瓶壁上的碳粒冲下，以促进消化完全
      • 若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生大量泡沫，少陵辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意控制热源强度
      • 若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L，2~3ml过氧化氢后再加热
      • 若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml比例来增加硫酸用量
      • 消化时间一般约为4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。一班消化至透明后，继续消化30分钟即可，但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸和组氨酸时，消化时间需延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量片偏低。但含铁量多时，程较深绿色
      • 蒸馏过程因主义接头处无松漏现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1分钟，将附着在尖端的洗手液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，决不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸
      • 硼酸吸收液的温度应不超过40℃，否则氨吸收减弱，造成损失，可至于冷水浴中
      • 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色
  • 双缩脲法
    • 传统的凯氏定氮法应用范围广、灵敏度高、准确，不要大仪器，但浪费时间，有环境污染。新开发的方法：紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等
    • 原理
      • 脲（尿素）NH2—CO—NH2加热至150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）
        • 测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化
    • 方法特点及应用范围
      • 本法林敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品的测定
    • 主要仪器
      • 分光光度计
      • 离心机
    • 试剂
      • 碱性硫酸铜溶液
      • 四氯化碳
    • 操作方法
      • 采用凯氏法测出的蛋白质样品为的标准曲线
• 氨基酸态氮的测定
  • 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，亮氨酸、 异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量具有极其重要的意义。
  • 方法
    • 双指示剂甲醛滴定法
      • 原理
        • 氨基酸具有酸性的-COOH和碱性的-NH2。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH，并用间接的方法测定氨基酸的总量。
      • 方法特点及应用
        • 此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；溶液中若存在其他物质可与甲醛反应，往往使结果高
      • 试剂
        • ①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。
        • ②0.1%百里酚酞乙醇溶液
        • ③0.1%中性红50%乙醇溶液
        • ④0.1mol/L氢氧化钠标准溶液
      • 操作方法
        • 移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份，分别置于250ml锥形瓶中，各加50ml 蒸馏水，其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为 琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置 1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录两次所消耗的碱液ml数
      • 结果计算
        • c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L; V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体sssss积，mL; V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL; m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol
    • 点位滴定法
      • 原理
        • 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。
      • 仪器
        • 酸度计（附磁力搅拌器