诊断学-0220临床常见病原体检测

诊断学-0220临床常见病原体检测学习笔记，适用于预习、复习的参照。适用于考前复习，也可以综合其他资料使用。

第9章 临床常见病原体检测

• 概述
  • 血液
    • 疑为菌血症、败血症和脓毒血症患者，一般在发热初期和高峰期采集，而已用过抗菌药物治疗者，则在下次用药前采集。
    • 采样以无菌法由肘静脉穿刺，成人每次10~20ml，婴儿和儿童每次1~5ml。
    • 条件允许时，最好能在床边接种，否则置于盛有抗凝剂聚茴香脑磺酸钠（ SPS ）的无菌瓶中送检。
    • 注意在检验申请单上注明抗生素使用情况，以选择合适类型的培养瓶。
  • 尿液
    • 外尿道寄居有正常菌群，故采集尿液时更应注意无菌操作。
    • 尿液标本一般取中段尿。
    • 对于厌氧菌的培养，采用膀胱穿刺法收集、无菌厌氧小瓶运送。
  • 分辨
    • 取含脓、血或黏液的粪便置于清洁容器中送检，排便困难者或婴儿可用直肠拭子采集，标本拭子置于有保存液的试管内送检。
    • 根据细菌种类不同选用合适的运送培养液以提高阳性检出率，如副溶血弧菌引起腹泻的粪便应置于碱性蛋白陈水或卡﹣布（ Cary - Blair ）运送培养液。
  • 呼吸道标本
    • 鼻咽拭子、痰、通过气管收集的标本均可作为呼吸道标本。
    • 后者可避免正常菌群污染，为下呼吸道感染病原学诊断的理想标本。
    • 鼻咽拭子和鼻咽洗液可供鼻病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、溶血性链球菌等的病原学诊断。
    • 上呼吸道标本存在正常菌群，在病原学诊断时需加以注意。
  • 脑脊液与其他无菌体液
    • 引起脑膜炎的病原体有脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等抵抗力弱，不耐冷、容易死亡，故采集的脑脊液应立即保温送检或床边接种。
    • 胸腔积液、腹腔积液和心包液等因标本含菌量少宜采集较大量标本送检，标本接种于血培养瓶，或经溶解、离心处理或过滤浓缩后再接种培养。
  • 眼、耳部标本
    • 用拭子采样，亦可在局部麻醉后取角膜刮屑。
  • 泌尿生殖道标本
    • 根据不同疾病的特征及检验项目采集不同标本，如性传播性疾病常取尿道口分泌物、外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物和前列腺液等。
  • 创伤、组织和脓肿标本
    • 对损伤范围较大的创伤，应从不同部位采集多份标本，采集部位应首先清除污物，以碘酒、乙醇消毒皮肤，防止表面污染菌混人标本影响检测结果。
    • 如果标本较少应加无菌等渗盐水以防干燥。
    • 开放性脓肿的采集，用无菌棉拭子采取脓液及病灶深部分泌物。
    • 封闭性脓肿，则以无菌干燥注射器穿刺抽取。
    • 疑为厌氧菌感染者，取脓液后立即排净注射器内空气，针头插人无菌橡皮塞送检。
• 检查方法
  • 直接显微镜检测
    • 标本直接涂片、干燥、固定后染色，或经离心浓缩集菌涂片染色，置光学显微镜下观察细菌的形态、染色性状或观察宿主细胞内包涵体的特征。
    • 另一种方法是采用悬滴法或压滴法，在不染色状态下借助暗视野显微镜或相差显微镜观察病原菌的生长、运动方式、螺旋体的形态和运动。
  • 病原体特异性抗原检测
    • 用已知抗体，借助免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等技术检测标本中未知的病原体抗原，其诊断价值常因标本不同而各异。
    • 标本中若存在多种正常寄居微生物，则因交叉抗原存在而不能确定诊断。
  • 病原体核酸检测
    • 目前，临床常用的核酸检测技术主要有 PCR 和核酸探针杂交技术。
    • PCR 能检测单个病原体，可快速检出生长极为缓慢，甚至不能在体外生长的病原体以及其他方法难以检测的标本。
    • 核酸探针杂交技术可检测临床标本中的许多细菌和病毒，但其敏感性尚不够满意。
  • 病原体的分离培养和鉴定
    • 细菌感染性疾病病原体的分离培养
      • 分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤。
      • 根据临床症状、体征和镜下检查特征做出病原学初步诊断，选用最合适的培养方法，根据菌落性状、生化反应、血清学实验、动物接种实验等做出鉴定，也可借助于微量鉴定系统快速简便鉴定分离菌。
      • 在鉴定细菌的同时，需做抗生素药物敏感试验。
    • 不能人工培养的病原体感染性疾病
      • 将标本接种易感动物、鸡胚或进行细胞培养。
      • 可根据动物感染范围、发病情况及潜伏期，初步推测为何种病原体。
  • 血清学试验
    • 血清学诊断对于某些病原体不能培养或难以培养的疾病，可以提供诊断的依据。但是，抗体检出最早也需在感染4~5天以后，一般在病程2周后效价才逐渐增高，因而它不适于疾病的早期诊断。
    • 在做血清学诊断时，一般要在病程早期和晚期分别采血清标本2~3份检查，如抗体效价在病程中呈4倍以上增长者有现症诊断价值。
    • 单份血清一般诊断意义不大，除非检测 IgM 。
    • 患者血清内 IgM 的检测有重要意义，不仅可做早期诊断，而且可区分原发性感染和复发性感染，前者急性期血清检出 IgM ，而后者为I gG 。
    • 临床医生必须合理选择试验项目达到确诊某一疾病、排除某一疾病或监测疾病治疗的效果。
• 乙肝病毒检测
  • HBV标志物检测与分析
• 其他检测
  • 核酸分子杂交
    • 常用的核酸分子杂交技术与评价
  • CNV测评
    • 双脱氧中止法测序
      • 应用最多的快速测序技术是双脱氧链终止法。
      • 双脱氧终止法操作程序是按 DNA 复制和 RNA 反转录的原理设计的，利用 DNA 聚合酶的酶促特点，以单链为模板合成 DNA 的互补链，利用24,3双脱氧核苷三磷酸做底物，使之连接在 DNA 链的3'末段，终止链的延长。
      • 原理
        • 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在的条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引人四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺人链端，该链就停止延长，链端掺人单
        • 脱氧碱基的片段可继续延长。
        • 如此每管反应体系中便合成以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。
        • 反应终止后，分四个泳道进行电泳。
        • 以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3'端的双脱氧喊基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
    • 化学修饰法测速
      • 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在的条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引人四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺人链端，该链就停止延长，链端掺人单
      • 脱氧碱基的片段可继续延长。
      • 如此每管反应体系中便合成以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。
      • 反应终止后，分四个泳道进行电泳。
      • 以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3'端的双脱氧喊基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
    • 自动测序技术
  • 聚合酶链反应
    • 聚合酶链反应（ PCR ）是在同一试管内利用 DNA 聚合酶催化的反应反复进行同一段 DNA 片段的合成。
    • 聚合酶反应的模板是待检测核酸分子。
    • DNA 可直接用于反应，而 RNA 则需要用反转录酶反转录成为 cDNA ，然后用于聚合酶反应的模板。
    • 反应的引物有两条，分别位于待扩增 DNA 片段的两端，可启动相对方向的 DNA 合成。
    • 这样从一个模板分子起始的话，经过 n 次聚合酶反应后就可以合成2n个模板分子。
    • 假如进行了30轮反应，对于一段500碱基对的 DNA 片段来说，这大约等于1ng的 DNA 。
    • 从很小量的样品即有可能扩增出电泳后肉眼可见的产物。
    • PCR 反应特异性强，灵敏度高，极微量的 DNA 即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。
  • 限制型片段长度多态性的类型
    • 点多态
      • 指单个碱基的改变引起酶切位点的出现或消失所致的 RFLP 。这样的多态位点目前已发现数百个。
      • RFLP 即属于这一类，称为经典的 RFLP 。
    • 数目变异的串联重复和卫星多态
      • 经典的单个碱基取代所致的 RFLP 一般只有一种杂合性的两种形式，即限制酶切点的有或无。每个位点在人群中的杂合子的频率通常不会超过50%。
      • 当被测个体为纯合状态时， RFLP 无法提供所需要的多态信息。
      • 在整个基因组中，这类 RFLP 的数量有限，且分布不均。
      • 除小卫星 DNA 外，基因组内还有一类微卫星 DNA ( microsatellite DNA )，它们的基因序列只有1~8dp，如（ CA ) n .( CIG ) n ,( CAG ) n 等，且通常只重复10~60次，在人群中也呈高度多态性，即不同个体所含有的拷贝数可有很大差异。
      • 包含微卫星 DNA 的片段可直接通过电泳方法检出。
    • RFLP的应用
      • RFLP 作为第一代遗传标记已经广泛地应用于遗传病的连锁分析中。
      • 根据这些广泛存在的遗传标记，应用定位克隆策略已成功地确定了100多种以孟德尔遗传方式为主的遗传病基因。
      • RFLP 还可用于基因组同源性分析以及个体识别，后者在法医学中已成为常规手段和方法。
• 诊断学 第4篇 第9章 临床常见病原体检测