【生化】03物质的生物合成-DNA的生物合成

生化物质的生物合成-DNA的生物合成知识点总结，详细的总结了复制，逆转录，损伤与修复的内容点梳理。

DNA的生物合成

• 复制
  • ◎①参与DNA复制的酶和因子是复制的基础，也是考察的重点。特别是原核的DNA pol Ⅲ和真核的DNA pol δ、拓扑异构酶、SSB应该重视。 ②对原核复制的起始和终止考察是比较细致的，请熟悉参与这两个阶段的酶及因子。真核的复制过程不需要掌握细节，但必须清楚真核与原核的不同点，尤其是端粒酶的组成。
  • 复制的规律和特点
    • 规律
      • ①半保留复制
        • 半保留复制： •亲代DNA双螺旋解开成为两条单链，各自作为模板，按照碱基互补配对原则合成与模板互补的子链，形成两个子代DNA双螺旋。 •每个子代双链DNA分子中都保留了一条来自亲代的单链，另一条是新合成的。因此，称为半保留复制。
        • 由于子代与亲代的遗传信息高度一致， 故半保留复制是生物遗传性状得以传递的基础
      • ②半不连续复制
        • 半不连续复制： 任何核酸子链的合成只能以5'→3'方向进行
        • 前导链：合成→DNA pol ε
          • 当亲代双螺旋沿某一个方向解开螺旋时，如果子链合成的方向与解螺旋的方向相同，能够以5'→3'方向连续合成。即为前导链或领头链。
        • 后随链：合成→DNA pol δ
          • 另一条子链的合成方向必定与解螺旋的方向相反，必须等模板链解开足够长度，才能沿5'→3'合成一段互补片段，这条子链的合成是不连续的。即后随链或随从链。
        • 冈崎片段：连接→RNA酶、DNA Pol Ⅰ、DNA连接酶
          • 后随链上不连续合成的片段是冈崎片段。 (DNA半不连续复制时出现的DNA片段)
        • ★Klenow片段： 实验室研究所用的工具酶
          • Klenow片段： DNA pol Ⅰ被水解切割成大、小两个片段后， 其中大片段具有5'→3'聚合作用和3'→5'外切酶活性 被称为Klenow片段
      • ③双向复制
        • 双向复制： 在复制时，DNA从起始点打开双链模板，向两个方向解链，形成方向相反的两个复制过程，故称双向复制。
        • 一个复制起点，形成两个复制叉，这两个复制叉前进方向相反
          • 复制中的模板DNA形成两个延伸方向相反的开链区。 子链沿模板延长所形成的暂时性Y字形结构称为复制叉
    • 特点
      • ①固定的复制起始点，富含A、T碱基
        • ♦原核环形DNA：只有1个复制起始点 ♦真核线性DNA：多个复制起始点
          • 由一个起始点完成的复制范围 称为一个复制子， 故多起点就是多复制子
      • ②合成方向：5'→3'，需要引物(提供3'-OH末端)
        • 需要引物： DNA聚合酶不能催化两个游离的脱氧核糖核苷酸脱水连接，因此DNA的合成不能从头开始，复制是需要引物的，DNA聚合酶可以在引物的3'-OH末端添加dNTP，催化合成3'，5'-磷酸二酯键，进行子链的延伸。
        • DNA聚合酶可以在引物的3'-OH末端添加dNTP， 催化合成3'，5'-磷酸二酯键，进行子链的延伸
      • ③高保真性
        • 高保真性： DNA复制具有高度保真性，是生物性状稳定遗传的基础 •高保真性复制主要依赖以下机制：
        • ♦碱基互补配对(A=T、G = C)：是复制遵循的基本规律
        • ♦DNA聚合酶对碱基的选择(ε亚基)
        • ♦DNA聚合酶对错配的碱基进行自我校读(3'→5'核酸外切酶活性)
        • DNA复制具有高度保真性： 生物性状稳定遗传的基础
    • DNA复制的实质
      • ♦单链DNA模板 ♦底物：dNTPs(AGCT四种脱氧的三磷酸核糖核苷酸) ♦引物：一小段RNA(合成时需要NTP为原料) ♦能量：ATP ♦各种酶和因子
      • DNA复制的实质： 以脱氧核糖核苷酸为底物， 在DNA聚合酶的催化下不断合成 3'，5'-磷酸二酯键的过程。
  • 参与复制的 酶与因子
    • ♦DNA聚合酶(DDDP)：依赖DNA的DNA聚合酶 ♦引物酶(DDRP)：依赖DNA的RNA聚合酶 ♦逆转入酶(RDDP)：依赖RNA的DNA聚合酶
    • DNA聚合酶
      • 原核
        • DNA pol Ⅰ：校读错误，空隙填补
          • ♦只有DNA pol Ⅰ有5'→3'外切活性 ★Klenow片段：实验室研究所用的工具酶
            • Klenow片段： DNA pol Ⅰ被水解切割成大、小两个片段后， 其中大片段具有5'→3'聚合作用和3'→5'外切酶活性 被称为Klenow片段
        • DNA pol Ⅱ：SOS紧急修复
        • DNA pol Ⅲ：复制延长子链 (复制中起主要作用)
          • ♦原核复制最主要的酶，负责延长子链， ♦多亚基不对称二聚体，连接3'，5'-磷酸二酯键； ♦5'→3'聚合作用；3'→5'外切活性校读错配 ♦不具备5'→3'外切活性
        • ♦都具有5'→3'的聚合作用； ♦都具有3'→5"外切活性(校读错配) ♦能够合成3，5'-磷酸二酯键 ♦只有DNA pol Ⅰ有5'→3'外切活性
      • 真核
        • DNA pol α：合成引物
        • DNA pol β：损伤修复
        • DNA pol γ：线粒体DNA复制
        • DNA pol δ：细胞核DNA复制， 真核染色质复制，后随链合成
        • DNA pol ε：校正错误，前导链合成
        • 5′→3'聚合酶活性； 能够合成3'，5'-磷酸二酯键
    • 拓扑异构酶
      • Ⅰ型：切断双链中的一股；不需要ATP
      • Ⅱ型：切断正超螺旋双股；形成负超螺旋；需要ATP
      • 解开、松弛超螺旋，切断DNA链； 能够合成3'，5'-磷酸二酯键
    • 解螺旋酶(解链酶)
      • 双螺旋解开成为单链；需要ATP
    • 单链结合蛋白(SSB)
      • 与单链模板(单链DNA)可逆结合
      • 防止单链重新形成双螺旋； 防止单链模板被核酸酶水解
    • 引物酶：特殊的RNA聚合酶
      • 合成RNA引物；连接3'，5'-磷酸二酯键
    • DNA连接酶
      • 连接双链中的单链缺口； 连接3'，5'-磷酸二酯键；需要ATP
        • ★注意DNA连接酶的特性， DNA复制，损伤修复，体外重组 在基因工程中一般只用来连接黏性末端
  • 复制过程
    • 原核
      • 起始
        • ★过程： ①DnaA蛋白辨认复制起始位点(oriC) ②DnaC蛋白的协助下DnaB(解螺旋酶)结合到oriC位点 ③拓扑异构酶松解超螺旋。 ④双螺旋打开成为两条单链，SSB蛋白结合到单链模板上 ⑤DnaG蛋白(引物酶)进入，形成引发体，并沿5'→3'方向以NTP为原料合成RNA引物，引物3'-0H为DNA聚合酶提供聚合延伸的起点，复制进人延长阶段。 ★参与大肠杆菌复制起始阶段的各种蛋白质均以Dna命名 ①DnaA蛋白：辨认起始点 ②DnaB蛋白：解螺旋酶 ③DnaC蛋白：协助Dna ④DnaG蛋白：引物酶
        • ①DnaA蛋白：辨认复制起始位点(oriC)→A为字母之起始
        • ②DnaB蛋白：解螺旋酶，解开DNA双链→解密
        • ③DnaC蛋白：协助Dna B结合到oriC位点
        • ④DnaG蛋白：引物酶，催化RNA的合成→G-钩子-勾引
        • DNA模板 → [Dna A蛋白辨认oriC] ↓超螺旋DNA→ [拓扑异构酶] ↓松弛双螺旋→ [解螺旋酶(Dna B蛋白)] ↓单链模板→ [SSB] 引物合成(引物酶Dna G蛋白)
      • 延长(DNA pol Ⅲ)
        • ★过程： ①领头链与模板解旋方向一致，连续合成。 ②后随链与模板解旋方向相反，不连续合成，出现冈崎片段。 ③每一个冈崎片段的合成均需要先合成引物，因此后随链上不断有引物酶合成引物 ④领头链的合成优先于后随链，但二者是由同一DNA pol I催化的。关键在于后随链的模板以“回环”方式存在，使得冈崎片段的合成能够与领头链同向。 ⑤拓扑异构酶、解螺旋酶、引物酶参与复制全程，后随链上的冈崎片段在延长阶段即可开始连接。 •起始、延长、终止没有明确界限，只不过是人为将复制过程划分为了三个阶段而已。
        • 在DNA pol Ⅲ催化下，按碱基互补配对原则依据模板序列从 5'→3'方向将底物dNTPs逐个加入到前一核苷酸3'-0H末端， 形成3'，5'-磷酸二酯键，使子链不断延长。
      • 终止：后随链上冈崎片段的连接
        • 主要是后随链上冈崎片段的连接，由三种酶共同完成。实际上，下述过程在延长阶段已经开始陆续进行，不必等到最后阶段才连接。
        • RNA酶：水解引物
        • DNA pol Ⅰ：填补空隙
        • DNA连接酶：连接片段、缺口
        • 冈崎片段连接： RNA酶、DNA Pol Ⅰ、DNA连接酶
    • 真核
      • 原核： ♦复制速度：快 ♦起始点数量：少 ♦引物：长(几十b) ♦冈崎片段：长(1000-2000b) ♦主要复制酶：Pol Ⅲ ♦端粒：无 ♦核小体重新装配：无
        • 真核： ♦复制速度：慢 ♦起始点数量：多 ♦引物：短(十几b) ♦冈崎片段：短(100-200b) ♦主要复制酶：Pol α/δ ♦端粒：需要 ♦核小体重新装配：需要
        • ★端粒酶= 端粒酶RNA模板 + 端粒酶逆转录酶 + 端粒酶协同蛋白
          • ★端粒酶： 包括端粒酶RNA、端粒酶逆转录酶和端粒酶协同蛋白，兼有RNA模板(富含C/A)和催化逆转录的功能；通过爬行模式完成末端复制。 →端粒酶的活性强弱可能与衰老、肿瘤发生有密切关系 •端粒： 真核线性染色体末端结构，是富含G/T的重复序列。 对维持染色体的稳定和DNA复制的完整有重要意义。
• 逆转录
  • 逆转录： 在逆转录酶催化下，以单链RNA为模板合成双链cDNA的过程。
  • 逆转录活性(RNA→DNA)
    • ①RNA→DNA合成： 逆转录活性以RNA为模板催化dNTP聚合生成DNA，形成暂时的RNA-DNA杂化双链。 ②水解RNA： RNA酶活性(RNase H)水解RNA-DNA杂化双链中的RNA。 ③DNA→DNA合成： DNA聚合活性催化互补DNA合成，生成cDNA(互补DNA)
    • ①逆转录酶的活性(RDDP)，生成cDNA(互补DNA)
    • ②RNA酶活性(RNase H：水解RNA)
    • ③DNA聚合活性(DDDP：DNA→DNA)
    • 逆转录酶：具有三种活性， 尤其是RNaseH活性， 需要引物，但无外切酶活性
  • 生物学意义
    • 完善中心法则；理解病毒致癌机理；生成cDNA(互补DNA)
• 损伤与修复
  • ◎这部分以DNA损伤的类型为主，尤其是点突变要结合鐮刀形红细胞贫血症理解。同时注意不需要复习第八版教材的章节。
  • 损伤类型
    • 点突变：只发生单个碱基改变
      • 错义突变：造成氨基酸改变(碱基错配)，如镰刀形红细胞贫血症
      • 同义突变：碱基改变不引起氨基酸改变
      • 无义突变
        • 无义突变：碱基改变造成转录产物mRNA上氨基酸的密码子改变为终止密码子
    • 插入和缺失：引起框移突变，破坏了遗传密码的连续性
    • 重排
      • 重排：DNA分子内较大片段的交换或位移称为DNA重排
  • 修复机制
    • 直接修复
      • 直接修复： 胸腺嘧啶二聚体(TT)是紫外线照射引起的DNA损伤，细胞内的光修复酶被活化后能使二聚体解聚，恢复原来的结构。
      • 胸腺嘧啶二聚体(TT)形成：紫外线照射引起的DNA损伤
    • 切除修复(碱基/核苷酸切除修复)
      • 切除修复： 切除修复是细胞内最重要和有效的修复机制。其过程包括识别损伤部位、切除损伤DNA、填补空隙和连接。在原核生物细胞内，切除修复是由UvrA、UvrB和UvrC三种蛋白形成的UvrABC复合物共同完成的。
      • 最重要和有效的修复机制，UvrABC复合物系统
    • 重组修复
      • 重组修复： 当DNA分子损伤面较大，不等修复完善就可能进人了复制过程，则母链损伤部位不能作为模板指导子链合成，结果造成子链出现缺口。子链DNA上的缺损可以由ReeA蛋白通过重组修复方式得以补充，而母链损伤部位无法修复。
    • SOS修复：紧急、广泛损伤、高错误率
      • SOS修复： 在DNA损伤广泛、难以继续复制的紧急状态下可启动SOS修复。该修复系统需要包括切除修复、重组修复在内的一系列蛋白组成网络来进行修复。由于是应急修复，出现错误的几率较高，受损伤的DNA也不能全部精确修复。