RNA的合成

生物化学，RNA的合成、poly A的有无与长短,是维持mRNA作为翻译模板的活性,以及增加mRNA本身稳定性的因素。一般真核生物在胞浆内出现的mRNA ,其poly A长度为100至200个核苷酸之间,也有少数例外。

RNA的合成

• RNA合成分类
  • 转录
    • 生物体以DNA为模板合成RNA的过程
    • DNA指导的RNA合成
  • RNA复制
    • RNA依赖的RNA合成
• 原核生物转录的模版和酶
  • 条件
    • DNA模板
    • NTP（ATP、UTP、CTP、GTP）
    • DNA依赖的RNA聚合酶（RNA pol）
    • 其他蛋白质因子
    • Mg离子和Mn离子
  • 合成方向
    • 5'→3'
  • 核苷酸间链接方式
    • 3',5'磷酸二酯键
  • 一、原核生物转录的模板
    • 结构基因：DNA分子上转录出RNA的区段
    • 模版链和编码链
      • 模版链
        • DNA双链中按碱基配对规律指引转录生成RNA的一股单链，称为模版链，也称为负/无义链（-）或Watson链
        • 模版链并非总是在同一单链上
      • 编码链
        • 相对模版链的另一条单链是编码链，也称为正/有义链（+）或Crick链
  • 二、RNA聚合酶催化RNA链合成
    • （一）RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成
      • 利福霉素：链霉素中分离的抗生素，结合β亚基，阻断转录起始
      • 利福平
        • 抑制RNA-pol，但引物酶对其不敏感
        • 转录起始后加入仍发挥其抑制转录的作用
      • DNA依赖的RNA聚合酶催化RNA合成的机制
        • RNA聚合酶和双链DNA结合时活性最高但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板
        • RNA聚合酶和DNA的特殊序列启动子结合后，就能启动RNA合成
        • DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长
    • （二）RNA聚合酶由多个亚基组成
      • 大肠杆菌内有一些不同的RNA pol全酶，其差异是σ亚基的不同。目前已发现多种亚基，并用其分子量命名区别，最常见的是σ70(分子量70 kDa). σ70是辨认典型转录起始点的蛋白质。大肠杆菌中的绝大多数启动子可被含有σ70因子的全酶所识别井激活
      • 但有些基因的启动子，如热激蛋白（Hsp）也为另外的σ亚基（σ32）识别
      • RNA聚合酶的结构
        • 起始需要全酶（核心酶+σ酶）
        • 全酶：α2ββ’ωσ,负责转录起始:
        • 核心酶：α2ββ’ω,负责转录延伸
          • 延长需要核心酶
          • α：组装核心酶；与调节序列相互作用
          • β:结合核苷酸，形成磷酸二酯键
          • β’:结合模板DNA:
          • ω:功能不清
        • σ:负责转录起始:
      • 原核生物RNA聚合酶的特征
        • 不同种细菌中核心酶大小比较恒定，σ因子变化较大
        • 不同的o因子识别不同的启动子，而使不同的基因得以表达
        • 细菌中的三种RNA由同一种RNA聚合酶转录
  • 三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录
    • 转录是不连续、分区段进行的
    • 每转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子
    • 操纵子包括若干个结构基因及其上游的调控序列
• 原核生物的转录过程
  • 原核生物转录过程和参与转录的物质
    • 原核生物的转录过程可分为起始、延长和终止三个阶段
    • 参与转录的物质
      • 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP)
      • 模板: DNA
      • 酶: RNA聚合酶(RNA-pol)
      • 其他蛋白质因子及Mg2+和Mn2+等
    • 合成方向5'→3' ,核苷酸间的连接方式为3' , 5'-磷酸二酯键。
  • 一、转录起始需要RNA pol全酶
    • 转录起始需解决两个问题
      • RNA pol必须准确地结合在转录模板的起始区域
      • DNA双链解开,使其中的一条链作为转录的模板
    • 转录起始过程
      • RNA聚合酶全酶(a2Bβ'σ)识别并结合启动子,形成闭合转录复合体
      • DNA双链打开,形成开放转录复合体DNA分子接近- 10区域的部分双螺旋解开后转录开始。DNA双链解开的范围只在17 bp左右,这比复制中形成的复制叉小得多
      • 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应,形成第一个磷酸二酯键
        • 5'-pppG-OH + NTP→5'-pppGpN - OH 3' + ppi
      • 转录起始复合物:
        • RNApol (a.2ββ'σ) - DNA - pppGpN- OH 3'
    • E.coli的转录起始和延长
      • 第一个磷酸二酯键生成后，转录复合体的构象发生改变，σ亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于DNA模板上，酶沿DNA链前移，进入延长阶段
      • 有些时候转录起始会发生流产式起始的情况
  • 二、RNA pol核心酶独立延长RNA链
    • 1、σ亚基脱落，RNA- -pol聚合酶核心酶变构,与模板结合松弛，沿着DNA模板前移
    • 2、在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链.不断延长
      • (NMP)n+ NTP→(NMP)n+1+ PPi
    • 大肠杆菌的转录泡局部结构示意图
      • 转录空泡：RNA-pol(核心酶)···DNA···RNA
    • 转录延长有以下特点
      • ①核心酶负责RNA链延长反应
      • ②RNA链从5'-端向3' -端延长,新的核苷酸都是加到3'-0H上
      • ③对DNA模板链的阅读方向是3'-端向5'-端,合成的RNA链与之呈反向互补,即酶是沿着模板链的3’向5'方向或沿着编码链的5’向3’方向前进的
      • ④合成区域存在着动态变化的8 bp的RNA-DNA杂合双链
      • ⑤模板DNA的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解链和再复合的动态变化。
    • 转录过程中DNA的超螺旋结构变化
  • 三、原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行
    • 在同一DNA模板上,有多个转录同时在进行
    • 转录尚未完成,翻译已在进行
  • 四、原核生物转录终止分为依赖p因子 与非依赖p因子两大类
    • （一）依赖ρ因子的转录终止
      • ρ因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质,亚基分子量46kD
      • ρ因子能结合RNA ,又以对poly C的结合力最强,但对poly dC/dG组成的DNA的结合能力就低得多
      • ρ因子还有ATP酶活性和解螺旋酶的活性。
    • （二）非依赖ρ因子的转录终止
      • DNA模板上靠近终止处,有些特殊的碱基序列,转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录
      • 茎环结构使转录终止的机制
        • 使RNA聚合酶变构,转录停顿
        • 局部RNA/DNA杂化短链的碱基配对是最不稳定的
        • RNA链上的多聚U也是促使RNA链从模板上脱落的重要因素
• 真核生物RNA的合成
  • 一、真核生物至少有三种DNA依赖的RNA聚合酶
    • 真核生物RNA聚合酶的组成
      • RNA聚合酶Ⅱ由12个亚基组成,其最大的亚基称为RBP1,与原核β'亚基同源
      • RBP2 ,与原核β亚基同源; RBP3 ,与原核α亚基同源;但没有任何亚基与σ因子同源
      • RBP1的羧基末端有一段共有序列为Tyr -Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段,称为羧基末端结构域(CTD)。CTD对于维持细胞的活性是必需的
      • RNA polI是真核生物中最活跃、最重要的酶，故本章叙述的真核生物的转录主要以RNApolⅡ所催化的转录反应为例
    • 不同RNA聚合酶使用不同类型的启动子
    • 核心启动子
      • 由4个元件组成:
        • TATA box : TATAAA
        • TFIIB识别元件(BRE )
        • 起始子(Inr): PyPyANT/APyPy (A is +1)
        • 下游启动子元件(DPE)
      • 不是每一个启动子中都必须包含所有元件;实际上在大多数启动子中，至少会缺失其中的一个元件
  • 二、 转录因子在真核生物转录起始中具有重要作用
    • 真核生物的基因转录过程,同样可以分为3个阶段:起始( RNApol和通用转录因子形成转录起始复合体)、延长和终止
    • 与原核生物的显著不同是,起始和延长过程都需要众多相关的蛋白质因子参与,这些因子被称为转录因子( TF )或反式作用因子
    • （一）转录前起始复合体的形成
      • 真核生物转录起始也需要RNA pol对起始点上游DNA序列进行辨认和结合,生成转录前起始复合体( PIC )
      • 转录起始时,真核生物的RNA pol不直接识别和结合模板的起始区,而是依靠转录因子识别并结合起始序列,故其起始复合体的装配过程比原核生物复杂的多
      • 能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质,现已发现数百种,统称为反式作用因子
      • 反式作用因子中,直接或间接结合RNA聚合酶的,则称为通用转录因子或基本转录因子
        • 通用转录因子的作用
          • 识别和结合核心启动子
          • 招募RNA polⅡ
          • 与其他DNA序列或调节蛋白相互作用
          • 仅支持本底水平的转录
      • 参与RNA-polI转录的TFⅡ的作用
        • 真核生物不同的RNA pol需要不同的基本转录因子( TF )配合完成转录的起始和延长。相对应于RNA polI、RNA pol II、RNA pol Ⅲ，这些TF分别称为TFI、TFII、 TFⅢ
      • 闭合转录复合体的形成步骤
        • 由TFIID中的TBP识别TATA盒,并在TAFs的协助下结合到启动子区,然后TFIB与TBP结合,同时TFIIB也能与DNA结合, TFIIA可以稳定与DNA结合的TFIIB-TBP复合体
        • TFIIB- TBP复合体与RNA pol II-TFIIF复合体结合,此举可降低；RNA pol II与DNA的非特异部位的结合,协助RNA pol II靶向结合启动子
        • TFIIE和TFIIH加入,形成闭合复合体,装配完成
      • TFIH的功能
        • TFIIH具有解旋酶活性,能使转录起点附近的DNA双螺旋解开,使闭合转录复合体成为开放转录复合体,启动转录
        • TFIIH还具有激酶活性,使RNA pol II的RBP1的CTD磷酸化
        • CTD磷酸化能使开放复合体的构象发生改变,启动转录。CTD磷酸化在转录延长期也很重要,而且影响转录后加工过程中转录复合体和参与加工的酶之间的相互作用
        • 当合成一段含有60 ~ 70个核苷酸的RNA时, TFIIE和TFIIH释放，TFIF留下，RNA pol II进入转录延长期。此后,大多数的TF就会脱离转录前起始复合物
      • 真核基因的转录起始还有其他转录因子的参与
        • 除了基本转录因子外,真核基因的转录起始还有其他转录因子的参与,如与启动子上游元件如GC盒CAAT盒等顺式作用元件结合的上游因子, 与远隔调控序列如增强子等结合的反式作用因子,以及在某些特殊生理或病理情况下被诱导产生的可诱导因子的参与
        • 不同物种、不同细胞或不同的基因,转录起始点上游都有不同的特异DNA序列,包括启动子、增强子等,统称为顺式作用元件
    • （二）少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录
      • 为了保证转录的准确性,不同基因需不同转录因子
      • 少数几个反式作用因子(主要是可诱导因子和上游因子)之间互相作用,再与基本转录因子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、RNA聚合酶结合,但有时也可直接与基本转录因子、RNA聚合酶结合
  • 三、真核生物转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象
    • 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似,但因有核膜相隔,没有转录与翻译同步的现象
    • RNA-pol前移处都遇上核小体
    • 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象
  • 四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行
    • 真核生物的转录终止,是和转录后修饰密切相关的
    • 真核生物mRNA有聚腺苷酸(poly A)尾巴结构,是转录后才加进去的
    • 转录不是在poly A的位置上终止,而是超出数百个乃至上千个核苷酸才停顿。已发现，在读码框架的下游，常有一组共同序列AATAAA,再下游还有相当多的GT序列，这些序列称为转录终止的修饰点
• 真核生物RNA前体的加工和降解
  • 几种主要的RNA转录后加工或修饰方式
    • 剪接
    • 剪切
    • 修饰
    • 添加
    • RNA编辑
  • 一、核不均一RNA经首、尾修饰和剪接后成为mRNA
    • 真核生物mRNA转录后 ,需要进行5'-端和3'端(首、尾部)的修饰以及对hnRNA进行剪接 ,才能成为成熟的mRNA,被转运到核糖体,指导蛋白质翻译
    • （一）前体mRNA在5'-末端加入“帽”结构
      • 大多数真核mRNA的5’-末端有7-甲基鸟嘌呤
      • 这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶,加帽酶和甲基转移酶催化完成
      • 帽结构的形成过程
      • 帽结构的意义
        • 使mRNA免遭核酸酶的攻击
        • 与帽结合蛋白质复合体结合, 并参与mRNA和核糖体的结合,启动蛋白质的生物合成
      • 帽子结构的功能
        • 保护mRNA,防止其被降解
        • 增强mRNA的可翻译性
        • 促进成熟mRNA从细胞核转运到细胞质中
        • 促进mRNA的拼接(有助于去除第一个内含子)
      • 只有RNA聚合酶II合成的转录产物( mRNA、部分snRNA)才有帽子结构
      • 因为加帽酶只能与RNA聚合酶II的CTD结构域结合:而CTD是RNA聚合酶II特有的
      • 加帽酶与CTD的磷酸化形式(延伸型)结合
      • 转录产物一旦从RNA聚合酶II中显露出来，可以与加帽酶接触
    • （二）前体mRNA在3'-端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾
      • 尾部修饰是和转录终止同时进行的过程
      • poly A的有无与长短,是维持mRNA作为翻译模板的活性,以及增加mRNA本身稳定性的因素
      • 一般真核生物在胞浆内出现的mRNA ,其poly A长度为100至200个核苷酸之间,也有少数例外
      • 前体mRNA分子的断裂和加多聚腺苷酸尾是多步骤过程
      • 加尾所需的蛋白质因子(反式因子)
        • 剪切与多聚腺苷酸化特异性因子(CPSF):特异性结合AauaAa signal
        • 剪切刺激因子(CstF):结合GU region、与CPSF结合
        • 剪切因子1和II (CFI、CF II):核酸内切酶
        • poly(A) 聚合酶(PAP)
        • PNA pol II
        • poly(A)结合蛋白(PABP)
      • 加尾过程
        • 第一阶段: CPSF识别AAUAAA信号，招募CFI、CFII、 CstF、 PAP等。CFI和II在下游切断RNA, PAP 添加约10个AMP ( 慢反应)
        • 第二阶段:PABP与已形成的polyA结合，PABP、CstF使反应加速，PAP继 续添加200个以上的AMP(快反应)
      • 尾巴的功能
        • 保护mRNA,防止降解
        • 促进mRNA的翻译
        • 促进mRNA从细胞核转运到细胞质
        • 提高mRNA的拼接效率(最后一个内含子的去除)
        • 产生终止密码子
        • 通过选择性加尾调节基因表达
    • （三）前体mRNA的剪接主要是去除内含子
      • 核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hnRNA), 也被称为前体mRNA(pre-mRNA)。
      • 在细胞核内出现的初级转录物的分子量往往比在胞质内出现的成熟mRNA大几倍,甚至数十倍。核酸序列分析证明, mRNA来自hnRNA ,而hnRNA和DNA模板链可以完全配对
      • 去除初级转录物上的内含子,把外显子连接为成熟RNA的过程称为mRNA剪接
      • 前体mRNA的剪接由剪接体完成。
      • 剪接体是由5种小核RNA (snRNA )和大约100种蛋白质组成
      • 小分子核糖核酸蛋白体(剪接体)
        • snRNA
        • 核内的蛋白质
      • 断裂基因
        • 断裂基因:真核生物结构基因,由若千个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成,去除非编码区再连接后,可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质,这些基因称为断裂基因
        • 外显子:在断裂基因及其初级转录产物上出现,并表达为成熟RNA的核酸序列,称为外显子
        • 内含子:隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列称为内含子
          • 内含子的序列特点
            • 初级转录产物含有可被剪接体所识别的特殊序列,其内含子两端存在一定的序列保守性
            • 内含子含有5 '剪接位点、 3 '剪接位点和内含子内的剪接分支点
            • 大多数内含子都以GU为5’端的起始,而其末端则为AG-OH-3'。5’GU......AG-OH-3称为剪接接口或边界序列
            • 剪接分支点多为腺苷核苷酸。剪接分支点有助于内含子形成套索RNA而被剪除
      • 剪接过程需要两次转酯反应和5种小核RNA(snRNA)的参与
      • 拼接过程
        • U1与内含子5'拼接点结合(CC)
        • 在ATP的帮助下，U2与分支点结合(A)
        • U4/U6和U5结合到拼接体中(B1)
        • U4与U6解离，U6取代U1 与5’拼接点结合，U1和U4离开拼接体，U6与U2配对(B2)
        • 在ATP供能的条件下完成第一步拼接反应(C1)
        • 在ATP供能的条件下完成第二步拼接反应(C2)
      • 前体mRNA分子有剪切和剪接两种模式
        • 前体mRNA分子的加工除上述剪接外,还有一种剪切模式
        • 剪切 :剪去某些内含子后,在上游的外显子3'-端直接进行多聚腺苷酸化,不进行相邻外显子之间的连接反应
        • 剪接:剪切后又将相邻的外显子片段连接起来,然后进行多聚腺苷酸化
      • 前体mRNA分子可发生可变剪接
        • 真核细胞基因的前体mRNA交替加工的两种机制
        • 许多前体mRNA分子经过加工只产生一种成熟的mRNA ,翻译成相应的一种多肽;有些则可剪切或(和)剪接加工成结构有所不同的mRNA ,这一现象称为可变剪接 , 又称选择性剪接
        • 大约5%的真核生物mRNA前体可以有多种拼接方式，产生2种以上不同的成熟mRNA,编码不同的蛋白质
        • 人体中大约60%的转录产物可以进行选择性拼接。拼接方式的转换与拼接定向有关
    • （四）mRNA编辑是对基因的编码序列进行转录后加工
      • 有些基因的蛋白质产物的氨基酸序列与基因的初级转 录物序列并不完全对应, mRNA上的一些序列在转录后发生了改变,称为RNA编辑
      • RNA编辑作用说明,基因的编码序列经过转录后加工,是可有多用途分化的,因此也称为分化加工
      • 哺乳动物中的RNA editing
        • 腺嘌呤核苷酸的脱氨: A转变为1,导致密码子含义的改变:如ACG (Thr)→ICG=GCG (Ala)
        • 催化脱氨反应的酶(ADAR)
      • RNA编辑的生物学意义
        • 消除基因突变带来的危害
        • 增加基因产物的多样性
        • 调控基因，与生物体生长发育有关
        • 使基因产物获得新的结构功能，有利于生物进化
        • 可能与学习和记忆有关
  • 二、真核rRNA前体经过剪接形成不同类别的rRNA
  • 三、真核生物前体tRNA的加工包括核苷酸的碱基修饰
    • 碱基修饰
      • (1) 甲基化，如: A→Am
      • (2) 还原反应，如:U→DHU
      • (3)核苷内的转位反应，如: U→ψ
      • (4) 脱氨反应，如: A→I
  • 四、RNA催化一些内含子的自剪接
    • 1982年美国科学家T. Cech和他的同事发现四膜虫编码rRNA前体的DNA序列含有间隔内含子序列,并且在没有任何来自四膜虫的蛋白质情况下, rRNA前体能准确地剪接去除内含子。这种由RNA分子催化自身内含子剪接的反应称为自剪接
    • Ⅰ和Ⅱ型内含子的剪切
      • Ⅰ型内含子:噬菌体的mRNA前体及细菌tRNA前体也发现有这类自身剪接的内含子，并被称为Ⅰ型内含子。Ⅰ型内含子以游离的鸟嘌呤核苷或鸟嘌呤核苷酸作为辅因子完成剪接。鸟嘌呤核苷或鸟嘌呤核苷酸的3’-OH与内含子的5’-磷酸共同参与转酯反应
      • Ⅱ型内含子：某些线粒体和叶绿体的mRNA前体和tRNA前体的另一类自身剪接的内含子
      • Ⅱ型内含子和剪接体型内含子的剪切过程都形成套索状结构,但Ⅱ型内含子没有剪接体的参与
  • 五、RNA在细胞内的降解有多种途径
    • 正常转录物和异常转录物的降解途径有一定差异
    • 正常转录物的降解途径包括依赖于脱腺苷酸化的mRNA降解和不依赖于脱腺苷酸化的mRNA降解(脱帽、核糖核酸内切酶、miRNA , siRNA)
    • 异常转录物的降解途径包括无义介导的mRNA降解、无终止降解、无停滞降解和核糖体延伸介导的降解等
    • 但细胞内少部分正常mRNA也可经由无义介导的途径降解
    • (一)依赖和非依赖于脱腺苷酸化的mRNA降解
    • (二)无义介导的mRNA降解是重要的真核细胞mRNA质量监控机制
      • 真核细胞mRNA的异常剪接可能会产生无义的终止密码子,由此产生的mRNA降解称为无义介导的mRNA降解( NMD) , 是广泛存在的mRNA质量监控的重要机制
      • 那些含有提前终止密码子( PTC )的mRNA会被选择性清除。