导图社区 4.法医DNA分析技术基础
法医物证学,法医DNA分析技术基础,整理了DNA提取、DNA定量、PCR(聚合酶链式反应)、DNA电泳的内容,有兴趣的可以看看哟。
编辑于2023-03-10 14:51:02 浙江省法医DNA分析技术基础
DNA提取
原则
①裂解细胞,释放DNA分子 ②将DNA分子与其他细胞物质进行分离 ③将DNA制备成可以进行PCR扩增等应用的形式
注意事项: ①防污染 ②大分子,保持DNA分子完整性,防止其降解 ③去杂质
方法
①有机溶剂提取法→饱和酚-氯仿提取法
C裂解(碱性和螯合剂EDTA)→分离DNA(SDS和蛋白酶K)→杂质去除(苯酚和氯仿)→DNA纯化(乙醇沉淀)
大分子纯度高
②盐析法
原理:DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,溶解度先增大后减小
简便快速质量高
③Chelex-100 提取法
Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂→螯合镁离子→核酸酶失活→保护DNA分子不被降解→煮沸碱性使膜破裂蛋白质变性→离心除去Chelex-100
优点: 在一个试管内进行→无转移→减少污染降低检材损失→适合微量检材提取,简单快速 缺点: DNA纯度不高,仅适用于PCR反应模板制备
④固相提取方法
是一种吸附层析方法,以固体吸附剂为固定相如瓷珠颗粒,以有机溶剂或缓冲液为流动相→利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离 高盐低PH→DNA结合在固相基质,低盐或水溶液→DNA被洗脱
适合从全血血痕体液及体液斑中提取DNA,特别适合自动化提取平台操作
DNA定量
为什么要PCR定量
①PCR对于DNA量要求严格→过多影响数据分析解释,过少丢失或扩增失败 ②混合样本→必要采取人类特异的DNA定量方法有选择地确定DNA的量
方法
①紫外分光光度法( 260nm)
吸收强度与核酸浓度呈正比 (1) 10OD→双链DNA50,单链DNA或RNA40,单链寡聚核苷酸20 (2) OD260/OD280→DNA为1.8,RNA为2
②琼脂糖凝胶电泳结合溴乙锭荧光测定法
溴乙锭(EB)可以嵌入双链DNA分子中,在紫外线照射下呈橙色荧光→荧光强度与EB的量呈正比,被结合的EB量与核酸呈正比→主观性半定量方法,低灵敏,无人类特异性
③荧光实时定量PCR技术
探针(5'-荧光基团,3'-淬灭基团)→PCR每复制一个特异核酸片段就有一个探针被切断,两个基团分离→荧光基团被激活而发荧光→荧光强度=扩增循环次数→检测到的荧光信号与标准曲线对照,测定模板拷贝数,具有极高的灵敏度和人类特异性
PCR(聚合酶链式反应)
在试管内经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍
原理
以拟扩增的DNA分子为模板,以一对寡核苷酸为引物,dNTP为合成DNA的原料,在DNA聚合酶的催化下,经过高温变性、低温退火和中温DNA链延伸三步骤的循环,使靶DNA得到复制
反应体系
①模板DNA:要扩增的基因片段即目的基因(1-10 ng)
②一对引物:引导DNA链的合成,“引子”
1)引物的碱基尽可能随机分布,G + C的含量宜在40~60%; 2)引物内部不应形成二级结构,尤其在其3′端; 3)两条引物之间,特别是3′端,不应有互补序列存在,避免形成引物二聚体; 4)引物的3′端与模板DNA一定要配对,否则影响延伸效率,以AT含量多为好,避免GC过多
③热稳定的DNA聚合酶(嗜热水生菌中提纯):催化DNA合成
70-75活性最高,没有校正功能,50PCR体系中需要0.5-2.5U
④四种三磷酸脱氧核苷(dNTP):合成DNA链的原料
20-200,四种浓度应均衡
⑤适当的缓冲体系:镁离子(1.5mmol/L~2.0mmol/L)
Taq DNA聚合酶必需的激活离子;浓度影响引物退火及延伸时特异性碱基的掺入
步骤
①变性(高温)→目的双链DNA片段在94℃下解链
② 退火(低温):两种引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过碱基配对结合
③延伸(中温):在Taq DNA聚合酶作用下, 以目的DNA为模板进行DNA合成
产物的积累规律
反应初期,目的DNA片断呈指数增加,之后减慢,进入平台期
原因 ①引物、原料消耗过多 ②酶活性下降;酶与PCR产物结合后,游离浓度降低 ③高浓度产物的抑制作用(使扩增产物解链不完全,降低Taq DNA聚合酶能力,非特异性产物与引物二聚体的竞争)
影响因素
①引物的质量
②Taq DNA聚合酶
5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性,但无3’-5’外切酶活性,对单核苷酸的错配无校正功能
③Mg 2+浓度
④dNTP浓度
过高会增加碱基的错误掺入率,使反应特异性下降;过低则会导致反应速度下降。
⑤退火温度
在Tm允许的范围内,选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合 Tm=4(G+C)+2(A+T)
法医学应用PCR技术特点
①高灵敏(理论上可检测单个体细胞的基因组DNA) ②高特异(引物特异性决定扩增片段特异性)③适用于降解DNA检材(2kb以下) ④种属特异性好(引物设计只能与人基因组发生退火)⑤复合PCR :用多对引物同时扩增数条DNA片段→常用于STR基因座检测
DNA电泳
基本概念原理
混合物中各种组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子量的不同→泳动的方向和速率不同→一定时间内各组分移动的距离也不同→各组分分离
电泳技术的种类
自由界面电泳(无支持介质的溶液中)
区带电泳(有支持介质)
醋酸纤维薄膜电泳;薄层电泳;凝胶区带电泳
DNA电泳技术
原理
DNA分子是两性电解质→pH值为3.5时带正电向负极泳动,pH为8.0~8.3带负电向正极移动
琼脂糖凝胶电泳
①DNA的分子大小(小的快) ②DNA分子的构象(超>线>开环) ③琼脂糖浓度(高慢低快) ④电源电压(低电压时,线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比) ⑤电泳温度影响不明显 ⑥嵌入染料(线状迁移率降低15%) ⑦离子强度(无离子不移动,高离子凝胶融化)
聚丙烯酰胺凝胶电泳
适合分离1kb以下的DNA片段,分辨率可达 1 bp
毛细管电泳
分辨率可高达1 bp;更有利于进行复合扩增产物的检测
电泳的影响因素
1.待分离生物大分子的性质
电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快
2.缓冲液的性质
pH值(接近等电点),离子强度,缓冲液的粘度
3.电场强度
电场强度越大,电泳速度越快;增大电场强度会使电泳过程产生的热量增大
4.支持介质
在筛孔大的介质中泳动速度快,反之,则泳动速度慢