第九章 基因克隆与基因外表达

第九章 基因克隆与基因外表达的思维导图，内容有重组DNA技术概念、基因克隆的工具酶、基因克隆的载体。

第九章 基因克隆与基因外表达

• 重组DNA技术概念
  • 1、应用工具酶在体外将某一基因或DNA片段与具有自主复制能力的载体DNA结合，形成重组DNA分子
  • 2、再将其导入宿主细胞
  • 3、并随宿主细胞的增殖而大量扩增，从而获得目的DNA的大量拷贝或表达有关基因产物
  • 过程
    • 分
    • 切
    • 接
    • 转
    • 筛
• 基因克隆的工具酶
  • 限制性内切核酸酶
    • 概述
      • 概念：是一种核酸内切酶，能识别双链DNA内部的特异序列（PS：该特异序列称为限制位点），并在该序列内部或其附近水解磷酸二酯键
      • 限制-修饰体系
        • 构成
          • 限制性核酸内切酶
          • 甲基化酶
          • 成对存在
        • 作用
          • 限制外切酶侵入
          • 保护细菌自身DNA
          • 维持细菌自身遗传信息稳定
    • 限制酶的分类与命名
      • 分类
        • Ⅰ型限制酶
          • 随机切割
          • 不产生特异DNA片段
          • 需要Mg2+、ATP、SAM作为辅助因子
          • 具有限制和甲基化修饰活性
        • Ⅱ型限制酶
          • 常用
          • 识别特异序列
          • 切割产生特异DNA片段
          • 需Mg2+作为辅助因子
        • Ⅲ型限制酶
          • 切割位点不固定
          • 不产生特异DNA片段
          • 具有限制和甲基化修饰活性
      • 命名
        • 第一个字母
          • 细菌属名
            • 大写
        • 第二个字母
        • 第三个字母
        • 细菌种名
          • 小写
        • 斜体
        • 第四个字母
          • 细菌菌株
            • 不区分大小写
        • 末尾罗马数字
          • 限制酶编号（多为发现顺序）
    • 限制酶的识别与切割
      • 切割概述
        • 识别序列
          • 4-8碱基对
          • 回文结构
        • 产生的DNA片段
          • 5‘为游离的磷酸基
          • 3’为游离的羟基
        • 切割末端
          • 粘性末端
          • 平末端
        • 切割酶
          • 异源同裂酶
            • 来源不同
            • 识别序列与切割位点相同
          • 同尾酶
            • 切割位点不同
            • 切割后产生的粘性末端相同
    • 影响切割的因素
      • DNA纯度
      • DNA甲基化程度
      • DNA结构
      • 反应温度
      • 反应体系
  • DNA连接酶
    • 大肠杆菌DNA连接酶
      • 只连粘性末端
      • NAD+供能
    • T4DNA连接酶
      • 连接粘性末端和平末端
      • ATP供能
  • DNA聚合酶
    • 分类
      • DNA聚合酶Ⅰ
        • 功能
          • 具有5‘—3’聚合酶活性
          • 具有5‘—3’外切酶活性
          • 具有3‘—5’外切酶活性
            • 具有校正功能
        • 用途
          • 合成cDNA第二链
          • 切口平移法标记DNA探针
          • DNA测序
      • Klenow片段
        • 产生
          • DNA聚合酶Ⅰ用枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段
            • PS：还产生一个小片段具有5‘—3’外切酶活性
        • 功能
          • 具有5‘—3’聚合酶活性
          • 具有3‘—5’外切酶活性
            • 具有较正功能
        • 用途
          • 补平5‘突出端或切除3’突出端，形成平末端
          • 双链DNA3‘端的标记
          • 制备探针
          • DNA测序
      • TaqDNA聚合酶
        • 耐热
        • 功能
          • 具有5’—3‘聚合酶活性
          • 具有5’—3‘外切酶活性
        • 用途
          • PS：无校对功能
          • PCR
          • DNA测序
      • 反转录酶
        • 功能
          • 能以单链mRNA为模板合成双链DNA
        • 分类
          • 禽成髓细胞瘤病毒反转录酶（AMV）
          • 莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（MoMLV）
        • 用途
          • 补平或标记5’粘性末端
          • 反转录合成cDNA
          • 制备探针
          • DNA测序
    • 作用
      • DNA体外扩增
      • DNA缺口填补
      • 探针标记
  • 修饰酶
    • 末端脱氧核苷酸转移酶
      • 功能
        • 催化dNTP掺入到DNA的3‘-OH端
          • PS:不依赖于模板的DNA聚合酶
      • 用途
        • 给DNA加同聚物尾
        • DNA片段的3’端标记
    • 碱性磷酸酶
      • 防止DNA/RNA的自连
      • 功能
        • 水解去除DNA或RNA5‘末端的磷酸基团，防止自身环化
      • 分类
        • 细菌碱性磷酸酶（BAP）
        • 牛小肠碱性磷酸酶（CIP）
    • T4多聚核苷酸激酶
      • 功能
        • 催化ATP（不是dATP）γ-磷酸基团转移到单链或双链DNA、RNA的5’OH端
      • 用途
        • 放射性标记DNA链的5‘端，用于DNA测序或探针制备
        • 将人工接头和其他没有5’端磷酸的DNA片段磷酸化，用于连接反应
    • 甲基化酶
      • 功能
        • DNA甲基化
      • 用途
        • 常用于某些酶切位点的甲基化，使之不被相应内切酶切割
  • 核酸酶
    • 脱氧核糖核酸酶Ⅰ
      • 功能
        • 随机水解双链或单链DNA
      • 用途
        • 切口平移法，制备DNA探针
        • 除去RNA样品中的DNA
    • 核糖核酸酶A
      • 功能
        • 特异性地攻击水解RNA
      • 用途
        • 除去DNA样品中的RNA
        • 除去RNA样品中未杂交的RNA
• 基因克隆的载体
  • 概述
    • 定义：携带目的DNA进入宿主细胞进行扩增或表达的工具，是一类DNA分子
    • 特征（选载体的要求）
      • 1、具有两个以上的遗传标记物，便于筛选和鉴定
      • 2、具有适当的大小，一般不超过10Kb
      • 3、具有自主复制能力（目的DNA不具有自主复制能力）
      • 4、多拷贝片段，易提取
      • 5、有合适的限制性内切酶酶切位点（多克隆位点 MCS）
  • 分类
    • 克隆载体
    • 表达载体
• 基因克隆的基本过程
• 克隆基因的表达
• 例：H（Haemophilus属）in（influenzae种）d （Rd株）Ⅲ（该菌株中第三个被分离得到的限制酶）