第九章 基因克隆与基因外表达 2

第九章 基因克隆与基因外表达 2的思维导图，携带目的DNA进入宿主细胞进行扩增或表达的工具，是一类DNA分子。

第九章 基因克隆与基因外表达 2

• 基因克隆的载体
  • 概述
    • 定义：携带目的DNA进入宿主细胞进行扩增或表达的工具，是一类DNA分子
    • 特征（选载体的要求）
      • 1、具有两个以上的遗传标记物，便于筛选和鉴定
      • 2、具有适当的大小，一般不超过10Kb
      • 3、具有自主复制能力（目的DNA不具有自主复制能力）
      • 4、多拷贝片段，易提取
      • 5、有合适的限制性内切酶酶切位点（多克隆位点 MCS）
  • 分类
    • 克隆载体
      • 为使插入的外源DNA扩增
      • 具有的元件
        • 复制起点：利用宿主的酶系统进行复制和扩增
        • 多克隆位点：外源DNA插入位点
        • 遗传标记：一种能产生表型的功能基因，用于筛选重组DNA阳性克隆
      • 分类
        • 质粒载体
          • 质粒基本概念：游离于细菌染色体外的小型双链环状DNA，能自主复制，是赋予细菌的某些特性的辅助性遗传单位，并非细菌生长必需，但对细菌的某些代谢活动和抗药性的表型有一定作用。
          • 质粒载体特点
            • 1、不依赖于细胞，多拷贝数
            • 2、具有遗传标记物，可用于筛选鉴定
            • 3、可在不同的细菌间进行转移
            • 4、在同一细胞中，同类质粒不相容
            • 5、具有分配功能，细胞分裂后，复制的质粒分配到子细胞中
          • 分类
            • 严密型质粒：复制与宿主染色体同步，拷贝数低
            • 松弛型质粒：在染色体复制停止，无蛋白质合成的情况下可继续复制，拷贝数低
              • 分子生物学中常用的质粒（但需经人工改造）
          • 常用质粒载体
            • 1、pBR322
              • 4.36 kb
              • 筛选标记：Amp r(PS:r在右上角)（氨苄青霉素抗性基因）、tet r（四环素抗性基因）
              • 筛选方法：双抗生素对照筛选
              • 多克隆位点
              • 优点及用途：
                • 1、分子量较小，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大
                • 2、具有两种抗菌素抗性基因可作为转化子的选择标记
                • 3、具有较高的拷贝数，为重组体DNA的制备提供了极大的方便
            • 2、pUC系列
              • 2.69 kb
              • 筛选标记：Amp r（氨苄青霉素抗性基因）、Lac Z基因
              • 筛选方法：抗生素蓝、白斑筛选
              • 多克隆位点
              • 优点及用途：适合于DNA片段的克隆，DNA测序以及外源基因表达
          • 缺点：插入的外源DNA片段较小（＜2kb），拷贝数相对较少
        • 噬菌体载体
          • 概念：噬菌体是可以感染细菌的病毒，由蛋白质外壳和核酸组成。核酸被包裹在头部，尾部的微丝可以把噬菌体的核酸注入细菌内。
          • 分类
            • λ噬菌体
              • PS：COS位点：由DNA分子的粘性末端结合形成的双联区段称为COS位点
              • 生物学特性
                • 线性的双链DNA分子，其两端各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5 ′单链突出序列即黏性末端。感染细菌后，λ噬菌体的线性DNA分子会迅速地通过黏性末端之间的互补作用形成环形双链DNA分子。
                • 生长方式
                  • 溶菌性生长
                  • 溶源性生长
              • 用途：可用于cDNA文库或基因组文库构建
              • 分类
                • 插入型载体：只有一个可供外源DNA插入的克隆位点（插入片段＜7kb）
                  • 可插入的DNA片段比质粒载体长很多
                • 替换型载体：成对的克隆位点，在两位点之间的DNA区段可被外源插入的DNA替换
            • 黏性载体（即λ噬菌体cos区域＋质粒）
              • 组成：质粒和噬菌体的cos粘性末端
              • 特点：
                • 质粒复制起点
                • 限制性内切酶位点
                • 抗药性基因
                • 噬菌体两端的cos位点
              • 优点：相对分子质量小，插入能力大（可达40~50kb）
            • M13噬菌体
              • 概念：只感染雄性大肠杆菌的丝状噬菌体，单链环状DNA分子。其基因组DNA经复制变成双链，称为复制型M13DNA，以其为模板可产生大量单链DNA，包装到成熟的噬菌体颗粒中被释放。
              • 优点：可用作克隆载体，最大的特点在于获得的克隆产物是单链DNA
              • 用途：DNA测序，探针制备和定点诱变
              • 生物学特性：单链环状DNA，在细菌内形成过渡的双链环状DNA，以成熟的单链形式分泌到培养基中
        • 病毒载体
          • 分类
            • 反转录病毒
            • 腺病毒
            • 腺相关病毒
            • EB病毒
          • 功能
            • 杀死肿瘤细胞
            • 纠正遗传缺陷
        • 酵母人工染色体（YAC）
          • 基于大片段DNA克隆的目的发展起来的技术，容量可达1000kb
        • 细菌人工染色体（BAC）
          • 插入片段平均大小为120kb，最大可达300kb
    • PS：载体容量
    • 表达载体
      • 为使插入的DNA表达（转录翻译成多肽链）
      • 可使插入的外源DNA在受体细胞内表达的一类载体，除具有克隆载体所具备的性质外，还带有转录和翻译所必需的DNA序列
      • 分类
        • PS：分为
          • 融合型表达载体：将单一外源基因插入表达载体，表达产物是单一的目的蛋白
          • 非融合型表达载体：将目的基因与编码另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合成插入片段并在菌体内表达
        • 原核表达载体
          • 例：
            • 大肠杆菌中的载体
            • 分岐杆菌中的载体
            • 放线菌中的载体
          • 除表达克隆载体中有的复制起始点，多克隆位点，抗性基因外，还含有启动子，核糖体结合位点（SD序列），翻译调控序列，终止子
            • 比克隆载体多出来的表达元件
              • 启动子：是RNA聚合酶转录起始点上游的结合序列
              • 核糖体结合序列（SD序列）：mRNA上游8—13个核苷酸处的共有序列5'-AGGAGG-3'
              • 翻译调控序列：起到翻译调控的作用
              • 终止子：基于转录终止信号的DNA序列，可通过自身核苷酸互补配对形成茎-环结构
        • 真核表达载体
          • pcDNA3是常用的真核表达载体
          • 除表达必不可少的原核元件：复制起始位点，抗生素抗性基因外，还含有与真核相关的 启动子、增强子、克隆位点、转录终止信号、poly(A)加尾信号
• 基因克隆的基本过程
• 克隆基因的表达
• 分 切 接 转 筛