细胞衰老与细胞死亡

重点介绍了细胞凋亡与细胞坏死，这也是这一章比较重要的部分

细胞衰老与细胞死亡

• 第二节 细胞死亡
  • 细胞死亡是指细胞生命现象的终结，有两种形式 ：
    • 细胞坏死（necrosis）：
      • 在外来致病因子作用下，细胞生命活动被强行终止所致的病理性、被动性的死亡过程。
    • 细胞凋亡（apoptosis）：
      • 在特定信号诱导下，细胞内的死亡级联反应被触发所致的生理或病理性、主动性的死亡过程。
  • 一、细胞死亡的类型与特征
    • （一）细胞死亡的原因
      • 细胞死亡
        • 正常死亡
        • 非正常死亡（细胞坏死）
          • 环境因子
            • 物理因素
            • 化学因素
            • 生物因素
          • 病理状态
    • （二）细胞死亡的特征与形式
      • 判断细胞是否死亡，可用特征性的形态改变为指标：
        • 如细胞核的核膜断裂，核仁溶解和消失等。
      • 细胞坏死时，质膜破裂，细胞解体并引起周围组织发生炎症反应；
      • 细胞凋亡时，质膜保持完整，形成凋亡小体（apoptotic bodies），不引起炎症反应。
      • 细胞焦亡时，细胞不断胀大直至细胞膜破裂，细胞内容物释放，激活强烈的炎症反应。
      • 判断细胞是否死亡，还应依据细胞是否还具有生理功能和繁殖能力。
  • 二、细胞凋亡的概念与特征
    • 细胞凋亡（apoptosis）：
      • 又称程序性细胞死亡 （programmed cell death, PCD） ，即在一定时间内，细胞按一定的程序发生死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选择性。
      • 细胞凋亡普遍存在于人类及多种动植物中，是多细胞生物体个体正常发育、维持成体组织结构不可缺少的部分，贯穿于生物全部的生命活动中。
      • （一）细胞凋亡的形态学特征
        • 主要包括细胞皱缩（cell shrinkage）、染色质凝聚（chromatin condensation）、凋亡小体形成、细胞骨架解体等，其中以胞核的变化最为显著。
          • 细胞核的变化：
            • 核DNA断裂浓缩成染色质块，呈多种形态核膜断裂，形成核碎片。
          • 细胞质的变化:
            • 胞质浓缩；
            • 线粒体增大，嵴增多，出现空泡化；
            • 内质网腔膨大；
            • 细胞骨架结构变得致密和紊乱。
          • 细胞膜的变化:
            • 原有的特化结构消失；
            • 细胞膜起泡，但仍保持完整；
            • 细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）翻转到细胞膜的表面。
          • 凋亡小体的形成有三种方式：
            • 发芽脱落机制；
            • 分隔机制；
            • 自噬体形成机制。
      • （二）凋亡细胞的生化改变
        • 1.DNA片段化
          • 细胞凋亡时，内源性核酸内切酶（endonuclease）活化，特异地在相邻核小体的连接区切断DNA链，形成长度为180~200bp整数倍的寡聚核苷酸片段，在进行琼脂糖凝胶电泳时， 凋亡细胞表现出特征性的DNA梯状条带（DNA ladders）。
        • 2. 细胞凋亡中的蛋白酶
          • 细胞凋亡是通过多种蛋白酶控制的，蛋白酶级联切割是凋亡最关键的过程。
        • 3. 胞浆Ca2+、pH的变化
          • Ca2+通过两条途径诱导细胞凋亡：
            • 胞内Ca2+库释放，胞外Ca2+内流，启动凋亡；
            • Ca2+的释放打破细胞内结构的稳定，触发凋亡。
          • 胞浆碱化和酸化均能影响细胞凋亡。
        • 4．线粒体在细胞凋亡中的作用
          • 凋亡时，线粒体发生一系列显著的变化：
            • 呼吸链受损，能量代谢受到破坏，导致细胞死亡；
            • 释放细胞色素C（cytochrome C, cyt C），激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；
            • 产生活性氧类物质（reactive oxygen species, ROS）；
            • 线粒体渗透转变孔（permeability transition pores, PT pores）通透性增高，触发级联反应。
        • 细胞凋亡的性质与细胞坏死完全不同，两者属于截然不同的细胞学现象。
          • 细胞凋亡和细胞坏死的区别
      • （三）失巢凋亡是又一种形式的细胞程序死亡
        • 是在脱离原来生存环境的特殊情况下发生的细胞凋亡，是因细胞与细胞外基质和其他细胞脱离接触而诱发的。
        • 在细胞分化生长周期短、组织更新快的细胞中表现更为明显。例如，小肠上皮细胞、骨骼肌细胞、胚胎成纤维细胞等。
        • 失巢凋亡的意义：
          • 防止脱落的细胞种植并生长于其他不适宜的地方。
          • 肿瘤细胞，尤其是转移的恶性肿瘤细胞，具有极强的抗失巢凋亡特性，从瘤体上脱落进入循环系统后并不发生凋亡，从而完成转移过程。
  • 三、细胞凋亡的影响因素
    • 细胞凋亡的发生受两种因素调节
      • 细胞凋亡的诱发因素：
        • 生理性诱导因子 ：肿瘤坏死因子、转化生长因子β、神经递质、Ca2+、糖皮质激素等；
        • 损伤相关因子： 热休克、病毒感染、细菌毒素、原癌基因、抑癌基因等。
        • 疾病治疗相关因子：化疗、放疗、生物治疗、中药治疗等；
        • 某些细胞毒性物质：如乙醇、氧化砷、β-淀粉样肽等。
      • 细胞凋亡的抑制因素：
        • 生理性抑制因子：如bcl-2原癌基因、突变型p53、各种生长因子、细胞外基质等。
        • 病毒基因：
        • 其他：线虫的ced-9基因、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、钙蛋白酶抑制因子、促癌剂。
  • 四、细胞凋亡的分子机制
    • （一）细胞凋亡受多种基因调控
      • 1. 调控细胞凋亡的ced基因和caspase基因家族
        • 与线虫细胞凋亡的相关基因可大致分为4组：
          • 第一组基因：包含ced-3、ced-4和ced-9基因，在线虫的凋亡调控中有重要意义；
            • ⑴ ced-3和ced-4基因：
              • 这两个基因的激活是线虫细胞凋亡起始或继续所必需的。
              • 表达时期：线虫胚胎发生期（凋亡多发期）。
              • ced-3的哺乳类同源物：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，它们共同特点是能特异性地断开天门冬氨酸残基后的肽键。
              • ced-4的哺乳类同源物：细胞凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1）。
            • ⑵ ced-9基因：
              • 与ced-4基因相反。抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活化，抑制线虫体细胞凋亡的发生，也称为“抗凋亡基因”（anti-apoptosis gene）。ced-9与哺乳动物的bcl-2家族具有一定的同源性。
          • 第二组基因：包含ced-1、ced-2、ced-5～ced-8以及ced-10，与凋亡细胞被吞噬清除过程有关；
          • 第三组基因：包含核酸酶基因1（nmc-1），并非凋亡所必需；
          • 第四组基因：包括ces-1、ces-2 以及egl-1和her-1，是影响特异细胞类型凋亡的基因，与某些神经元和生殖系统体细胞的凋亡有关。
      • 2.既能抑制又能促进细胞凋亡的bcl-2基因家族
        • bcl-2基因是B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2, bcl-2)的缩写。
          • 有的成员对凋亡起抑制作用，如Bcl-2；
          • 有的成员是凋亡的促进者，如Bad、Bax等。
      • 3.可促进细胞凋亡的ice基因
        • 白细胞介素-1β转换酶（interleukin-1β converting enzyme, ICE）基因与线虫的ced-3基因在DNA序列上高度同源。
        • ICE蛋白是一种半胱氨酸蛋白酶，其作用是将前白细胞介素-1β分解成有生理活性的白细胞介素-1β。
      • 4. 参与调节细胞凋亡的p53基因
        • P53是抑癌基因，能引起细胞周期阻滞、诱导凋亡和促进细胞终末分化。
        • 人类p53蛋白存在两种形式，二者均参与调节细胞凋亡：
        • 野生型（wt p53）：对细胞增殖、转化有抑制作用，故能促进凋亡。
        • 突变型（mt p53）：可灭活野生型的功能，抑制凋亡并导致细胞转化和过度增殖而产生肿瘤行为。
      • 5. 可触发细胞凋亡的Fas和FasL
        • Fas是属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor, TNFR）和神经生长因子受体（nerve growth factor receptor, NGFR）超家族的细胞表面分子。
        • Fas配体(Fas ligand, FasL)是TNF家族的细胞表面分子。
          • FasL与其受体Fas结合将导致携带Fas的细胞凋亡。
        • Fas/FasL的重要生理作用表现在：
          • Fas/FasL触发细胞凋亡。
          • Fas/FasL对免疫系统细胞的死亡起重要作用。
          • Fas/FasL介导免疫“赦免”。
      • 6. C-myc基因既是凋亡的激活因子又是抑制因素
        • C-myc基因可以产生两种翻译产物c-Myc1和c-Myc2，两者的作用不同，有时甚至是相反的，受作用细胞的微环境、时期、位点以及自身的质和量的影响。
        • C-myc主要参与转录，既是凋亡的激活子又是凋亡的抑制因素。
    • （二）细胞凋亡的信号转导通路主要由死亡受体和线粒体介导
      • 细胞凋亡的信号传导途径具有以下特点：
        • 传导途径的启动可因细胞的种类、来源、生长环境及诱因的不同而存在差异；
        • 凋亡信号传导系统具有多样性；
        • 细胞凋亡的信号途径与细胞增殖、分化的途径存在一些共同通路；
        • 凋亡的多条信号途径间存在互通的交叉部分。
      • 1.死亡受体介导的信号转导通路
        • 细胞外的许多信号分子可以与细胞表面相应的死亡受体（death receptor, DR）结合，激活细胞凋亡信号通路，导致细胞凋亡。
        • 哺乳动物的死亡受体属于肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族，主要成员有Fas/Apo-1/CD95，DR-4/TRAIL-R1，DR3 /WSL-1/Apo-3/TRAMP等。
        • 配体FasL与死亡受体Fas结合后，诱导Fas 胞质区内的死亡结构域( death do-main,DD)结合Fas结合蛋白(FADD) ,FADD再以其氨基端的死亡效应结构域结合caspase-8 前体,形成Fas-F ADD-caspase-8前体组成的死亡诱导复合物( death inducing signaling complex, DISC)，激活caspase-8 ,活化的ceaspase-8可以进步激活执行死亡功能的效应蛋白caspase-3,6,7 等，导致细胞凋亡。
      • 2. 线粒体介导的信号转导通路
        • 线粒体在细胞凋亡中处于凋亡调控的重要位置，许多凋亡信号（如DNA损伤、氧化剂等）都可以引起线粒体的损伤和膜渗透性改变。
          • Bcl-2家族的蛋白定位于线粒体膜上，阻止cyt C从线粒体释放来抑制凋亡；
          • BAX与线粒体上的膜通道结合，促使cyt C的释放而促进凋亡。
  • 五、细胞凋亡的检测
    • （一）形态学检测
      • 普通光学显微镜：HE染色、甲基绿－派诺宁染色、Giemsa染色；
      • 荧光显微镜：荧光（如吖啶橙、Heochst33258染色）；
      • 电子显微镜：超薄切片。
    • （二）生化特征检测
      • 细胞凋亡最显著的生化特征：内源性核酸酶激活后，染色体断裂形成约为180~200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段。
      • 可用下述方法检测：
        • 琼脂糖凝胶电泳法；
        • 原位末端标记法；
        • ELISA法。
    • （三）流式细胞仪检测
      • 流式细胞仪检测凋亡的原理：
        • 凋亡使细胞在细胞、亚细胞和分子水平发生特征性改变，造成荧光染料对凋亡细胞DNA可染性（DNA stainability）发生改变；
        • 凋亡使细胞形态发生改变，影响光散射特性。
  • 六、细胞凋亡与疾病
    • （一）细胞凋亡过低导致相关的疾病发生
      • 肿瘤：凋亡抑制基因和凋亡活化基因表达异常。
      • 系统性红斑狼疮：Fas表达缺陷，导致T淋巴细胞凋亡障碍。
    • （二）细胞凋亡过度导致相关的疾病发生
      • 神经退行性疾病；
      • AIDS；
      • 心血管疾病。
• 第三节 细胞自噬
  • 一、细胞自噬的定义与分类
    • （一）细胞自噬的定义
      • 是生物进化中被优先保留下来的一种维持细胞稳态的生理机制。
        • 细胞自噬（autophagy）：胞浆内大分子物质和细胞器在膜包囊泡中大量降解的生物学过程。
        • 意义
          • 通过自噬实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新。
          • 细胞自噬与生物体的发育、分化相关。
    • （二）细胞自噬可区分为三种类型
      • 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种主要类型：
        • 微自噬（micro-autophagy）：底物被溶酶体的膜直接包裹并降解。
        • 巨自噬（macroautophagy）：是自噬形式中最普遍的一种。底物被非溶酶体来源的双层膜包裹，形成自噬泡，在溶酶体中降解。
        • 分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA） ：分子伴侣与底物蛋白分子结合，与溶酶体膜受体结合后，在溶酶体内降解，整个过程不需要囊泡的参与。
      • 根据对降解底物的选择性，细胞自噬又分为两种主要类型：
        • 非选择性自噬：蛋白质或细胞器被随机运送到溶酶体中降解。
        • 选择性自噬：对降解的底物具有专一性，通过对待降解底物的识别传递和利用自噬核心机制来实现降解。
  • 二、细胞自噬的发生过程与调控
    • （一）细胞自噬的发生过程
      • 底物诱导自噬前体（proautophagosome, PAS）的形成：细胞胞浆中出现游离双层膜结构。
      • 自噬体形成：自噬前体包裹细胞质或损伤/衰老的细胞器。
      • 自噬体与溶酶体融合：形成自噬溶酶体（autophagolysosome or autolysosome）。
      • 自噬体内容物被降解。
  • 三、细胞自噬的医学意义
    • 自噬可以帮助细胞抵抗衰老、饥饿等外界压力，但过度的自噬又将导致细胞发生程序性死亡，被称为II型凋亡。
    • 自噬作用在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键，对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以及对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用。
    • 在恶性肿瘤的进展阶段，自噬可以帮助癌细胞对抗营养缺乏和缺氧，尤其是血供不良的实体性肿瘤。
    • 研究表明，某些抗肿瘤治疗药物有可能通过自噬机制发挥作用，如用于乳腺癌治疗的药物它莫西芬。
• 第一节 细胞衰老
  • 一、细胞衰老的概念
    • 细胞在正常条件下发生的生理功能衰退和增殖能力减弱以及形态发生改变并趋向死亡的现象 。
    • 细胞衰老是机体衰老和老年病发病的基础。
    • （一）细胞衰老与机体的衰老既有区别又有联系
      • 机体衰老
        • 指绝大多数生物性成熟以后，机体形态结构和生理功能逐渐退化或老化的过程，是一个受发育程序、环境因子等多种因素控制的、不可逆的生物学现象。
      • 细胞衰老与机体衰老的区别
        • 机体的衰老与动物的寿命密切相关； 个别细胞，甚至机体局部许多细胞的衰老死亡并不影响机体的寿命。
        • 机体衰老并不代表所有细胞的衰老。
      • 细胞衰老与机体衰老的联系
        • 机体衰老与细胞衰老之间有着密切的联系，机体衰老以细胞总体的衰老为基础 。
    • （二）机体内各类细胞的寿命不同
      • 根据细胞寿命情况将细胞分为三类：
        • 细胞寿命接近于动物的整体寿命
          • 如神经元、脂肪细胞、肌细 胞等。
        • 缓慢更新的细胞，其寿命比机体的寿命短
          • 如肝细胞、胃壁细胞等。
        • 快速更新且寿命较短的细胞
          • 如皮肤的表皮细胞、红细胞和白细胞等。
    • （三）细胞在体外培养条件下的寿命
      • 离体细胞同在体细胞一样，也有一定的寿命，其寿命长短取决于培养细胞的平均代数、所取培养组织的年龄、种属等。
      • Hayflick 界限（Hayflick life span）：体外培养细胞所具有增殖分裂的极限。
  • 二、细胞衰老的表现
    • （一）细胞衰老的形态学改变
    • （二）细胞衰老的分子和代谢改变
      • DNA
        • 复制与转录受到抑制；
        • 有个别基因会异常激活；
        • 端粒DNA丢失，mtDNA特异性缺失；
        • DNA氧化、断裂、缺失和交联；
        • 甲基化程度降低。
      • RNA
        • mRNA和tRNA含量降低
      • 蛋白质
        • 含量下降；
        • 发生修饰反应；
        • 稳定性、抗原性和可降解性下降；
        • 肽键断裂、交联变性。
      • 酶
        • 活性中心被氧化，总的效应是酶失活；
        • 但β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase ， SA-βgal）活性增强
      • 脂类
        • 不饱和脂肪酸被氧化，膜的流动性降低
  • 三、细胞衰老的学说与机制
    • （一）细胞衰老的学说
      • 1.遗传决定学说
        • 衰老是遗传上的程序化过程，其推动力和决定因素是遗传的基因组；控制生长发育和衰老的基因都在特定时期有序地开启和关闭。
        • 与衰老有关的基因
          • 衰老相关基因（senescence associated gene）
            • 细胞衰老时，表达水平显著高于年轻细胞。
            • 如：MORF4基因， p16基因 。
            • p16被视为细胞寿命的关键调控基因，是人类细胞衰老遗传控制程序中的关键效应物。
          • 抗衰老基因，也称长寿基因（longevity gene）
            • 如：WRN基因， Klotho基因和SIRT1基因。
      • 2. 自由基学说
        • 在代谢过程中产生的活性氧基团或分子(OH，H2O2，超氧自由基)引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。
        • 在正常条件下，人体内自由基的产生有两方面：
          • 外源性自由基：由环境中的高温、辐射、光解、化学物质等引起。
          • 内源性自由基：由体内各种代谢反应产生，是人体自由基的主要来源。
        • 产生的途径
          • 由线粒体呼吸链电子泄漏产生;
          • 由多功能氧化酶等催化底物羟化产生;
          • 非酶促反应产生 。
        • 自由基导致细胞损伤
          • 质膜中不饱和脂肪酸氧化，导致膜运输功能紊乱以至丧失。
          • 蛋白质的巯基化，造成蛋白质发生交联、变性，使酶失活。
          • DNA链的断裂、交联、碱基羟基化、碱基切除等，对DNA造成损伤。
          • 有人认为在衰老的原因中，99％是由自由基造成的。
      • 3. 端粒钟学说
        • 端粒随细胞的分裂不断缩短，当端粒长度缩短到一定阈值时，细胞就进入衰老过程。
        • 端粒：是染色体末端由简单串联重复序列组成的特殊结构；细胞分裂过程中，端粒不能完全复制而逐渐变短。
        • 端粒酶：是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，可使端粒长度增加，常见于生殖细胞和肿瘤细胞等细胞中。
        • 目前人们根据端粒与端粒酶在细胞衰老上的研究成果，将细胞衰老区分为两大类
          • 与端粒、端粒酶直接相关的复制性衰老；
          • 氧化应激诱导的非端粒依赖性衰老，也被称为早熟性衰老（premature senescence）。
      • 4. 代谢废物积累
        • 由于细胞功能下降，细胞既不能将代谢废物及时排出胞外，又不能将其降解与消化，导致代谢废物越积越多，影响细胞代谢废物的运输，阻碍了细胞的正常生理功能，最终引起细胞的衰老。如哺乳动物脂褐质的沉积。
      • 5. 基因转录或翻译差错学说
        • 随着年龄的增长，细胞内DNA复制效率下降，常会发生核酸、蛋白质、酶等大分子的合成差错，差错的积累最终引起细胞功能降低，并逐渐导致细胞衰老、死亡。
    • （二）复制性细胞衰老和氧化应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老的调控
      • 未能通过G1/S检查点的细胞将退出细胞周期，并走向衰老。
      • 目前认为，主要有两条途径调控细胞的衰老
        • 复制性细胞衰老依赖于p53→p21、pRb→E2F信号通路的调控；
        • 氧化应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老受ERK→ p38MAPK → p16 → pRb 信号通路的调控 。
  • 四、细胞衰老与疾病
    • 细胞衰老与早老性疾病有关，如Hutchinson-Gilford和Werner早衰症。
    • 一般认为，细胞衰老与老年性疾病如神经退行性疾病、动脉粥样硬化性心血管疾病、糖尿病及肿瘤等密切相关。
    • 研究表明，组织干细胞衰老是机体衰老的重要原因之一，也与某些老年性疾病的发生相关联。