PCR原理

PCR原理，DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成， 通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。

PCR原理

• 前言
  • DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成， 通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’—OH末端，并以此为起始点，沿模板5’→3’方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA（待扩增DNA）引 物、4 种 脱 氧 核 苷 酸 （dNTPs）、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。
• PCR反应基本成分
  • 模板DNA
    • 可以是单链或双链DNA，基因组DNA活cDNA，mRNA（需用逆转录酶转录为cDNA）
  • 引物
    • PCR引物是一段与待扩增的目标 DNA 序列侧翼片段互补的寡核苷酸片段，长度大多为10—30个碱基。通常，一对引物包含5’端与正义链互补的寡核苷酸片段和3’端与反义链互补的寡核苷酸片段，这两个寡核苷酸片段在模板 DNA 上的结合位置之间的距离决定 PCR 扩增片段的长度。
      • 正义链，反义链——mRNA转录时结合的那条链称之为模板链，即碱基互补配对的那条链，那么由此可知非互补的链是非模板链。根据碱基互补原则我们可以知道，非模板链的碱基顺序和mRNA是一致的（除了其中的U/T替换）。显然，这条非模板链对于mRNA是有意义的，存储着mRNA的编码信息，因此这条链也被称为编码链（coding strand）或者正义链（sense strand）。mRNA的序列信息对应着编码链5'->3'方向的序列信息（碱基顺序一致）。有了编码链就肯定有非编码链，所以模板链也就是非编码链或者反义链。
  • dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）
    • 是PCR反应中靶 DNA 序列扩增的原料
  • DNA聚合酶
    • 最初为从大肠杆菌中提取的DNA聚合酶I的Klenow片段，该片段具有聚合酶活性和3’→5’外切核酸酶活性，能识别和消除错配的引物末端，以校正复制过程中错配的核苷酸，高温失活
    • 水生栖热菌（Taq）
      • 具有95℃以上的耐热性，Taq DNA聚合酶没有3’→5’外切核酸酶 活性，缺乏校正错配核苷酸的能力‚通常错配率约为2×10*（-4）
    • Pfu DNA聚合酶
      • 具有高保真性能的高温 DNA 聚合酶，来源于高温嗜热菌 Pyrococcus furiosis
    • 其他：Tth DNA聚合酶，Tf1 DNA聚合酶，Tli聚合酶，Platium Pfx DNA 聚合酶，Platium DNA 聚合酶
  • 缓冲液
    • PCR 反应的标准缓冲液通常含有10mmol／L Tris-HCl（pH8.3），50mmol／L KCl 和1.5mmol／LMgCl2，这种标准缓冲液在72℃温育时，反应体系的 pH 值会下降1个多单位，使缓冲液的 pH 值接近7.2，基本适用于各种模板、寡核苷酸引物，但对某些模板与引物的特定组合就不一定最佳，用时需再作适当调整。
  • Mg2+及其他成分
    • PCR 反应体系中 Mg2＋的浓度十分重要，适宜的 Mg2＋浓度为高于 dNTP 总浓度0∙5—2∙5mmol／L。当 dNTP 浓度为0∙2mmol／L 时，建议 Mg2＋的浓度为1mmol／L。Mg2＋ 浓度过高，容易生成非特异性扩增产物；反之，浓度过低会使 PCR 产量降低。Mg2+有效浓度受到高浓度的螯合剂如EDTA、高浓度的带负电荷离子基团如磷酸根影响，首次使用时需要将Mg2+浓度调整为最佳
• PCR反应程序参数
  • 变性温度和时间
    • 变性的目的是要使双链 DNA 完全解链成单链。原则上变性步骤要高温、短时，既要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。若变性不充分，DNA 双链会很快恢复，PCR 产物就会明显减少；反之，变性温度过高、时间过长，会加快酶的失活。
    • 典型的变性条件是95℃，时间30秒，对 GC 含量多的靶 DNA 序列宜用较高的变 性温度
    • 在解链温度 （Tm） 下，DNA 的变性仅需几秒钟。Tm 值可根据靶 DNA 中 G＋C 含量按公式 Tm＝81.5-16.6 lg［Na＋］＋0.41（G＋C）％ - 600／N 来计算，其中 N 为链长。
  • 引物退火温度和时间
    • 退火的作用是使模板 DNA 单链或上一轮的反应产物与引物相结合。退火温度是指引物与模板特异结合的最佳温度，是任何 PCR 反应最重要的参数。引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应成分中的浓度。通常退火温度比引物的解链温度 （Tm） 低5℃，一般用37—55℃或高一点，时间1min。
  • 引物延伸温度和时间
    • 引物延伸是 DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物3'—OH 末端，依据模板序列合成一条互补新链的过程。引物延伸温度取决于 DNA 聚合酶的最适温度
  • 循环次数
    • DNA 双链高温变性、引物退火和新链延伸这三个步骤反复循环的次数通常需要25—40个。若PCR 反应中各项参数适宜‚其适宜的循环次数主要取决于靶 DNA 的起始浓度。
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