遗传病的诊断

遗传病诊断指临床医生根据患者的症状、体征以及各种辅助检查结果并结合遗传学分析，从而确认其是否患有某种遗传病并判断其遗传方式及遗传规律。下图为遗传病诊断相关笔记总结。

13、遗传病的诊断

• 总论
  • 指临床医生根据患者的症状、体征以及各种辅助检查结果并结合遗传学分析，从而确认其是否患有某种遗传病，并判断其遗传方式及遗传规律
  • 是开展遗传咨询和遗传病防治工作的基础
  • 包括：现症病人诊断、症状前诊断、产前诊断、植入前诊断
• 临床诊断
  • 主要内容包括询问病史、检查症状和体征、根据收集的资料绘制系谱和系谱分析等
  • 症状诊断
    • 病史
      • 家族史
      • 婚姻史
      • 生育史
    • 症状与体征
      • 苯丙酮尿症
      • 血友病
      • 唐氏综合症
      • 性染色体病
  • 系谱分析
    • 定义
      • 是在对先证者的症状、体征、实验室检查和其他辅助检查做出诊断之后，进一步追溯家系中其他成员，绘出系谱图，然后分析该家系可能遵循的遗传方式并预测后代的发病风险
    • 内容
      • 孟德尔式遗传病
        • 常染色体显性遗传病
          • 外显率、表现度、性别影响、基因多效性
        • 常染色体隐性遗传病
          • 遗传异质性
            • 基因座异质性：双重杂合子
            • 等位基因异质性：遗传复合体
        • Ｘ连锁遗传病
          • 半合子、交叉遗传、lyon化
      • 非孟德尔式遗传病
        • 线粒体遗传病
          • 母系遗传
          • 晚发、进行性疾病
        • 多基因遗传病
          • 出生缺陷
          • 慢性晚发性疾病
          • 家族聚集性
      • 具有特殊遗传方式的疾病
        • 遗传印记
          • 来自双亲的同一基因或染色体区域的表达不是等同的，这些等位基因在传递上符合孟德尔遗传规律，但在表达方面受传递的双亲性别影响
        • 动态突变
    • 意义
      • 准确而有效地记录家族史，以图解的方式提供各种信息，易于分析和解释
      • 判断遗传病的遗传方式
      • 用于遗传咨询中个体患病风险的计算
      • 有助于区别某些表型相似的遗传病，以及同一遗传病的不同类型
      • 可鉴别由于遗传异质性造成的遗传方式的混淆
    • 绘制系谱过程中要注意的问题
      • 系统性、完整性
        • 三代以上各个成员的资料
        • 死者的死因调查及核查
        • 近亲婚配、死胎、流产和新生儿死亡等
      • 去伪存真
        • 患者及家属提供资料
        • 遗传咨询医师核实资料
      • 注意新的基因突变
        • 适合度低的显性遗传病或XR遗传病
  • 一般检查
    • 生化检查
    • 影像学检查
    • 电生理检查
    • 病理检查
  • 症状前诊断
    • 对遗传病家系中的患病高风险个体在症状出现前进行的一种临床诊断，主要针对某些延迟显性遗传病的杂合子个体
• 细胞学诊断
  • 染色体显带核型分析
    • 标本来源
      • 患者的外周血和身体的各种组织进行现症患者的检查
      • 胎儿的皮肤、脐带血、受精卵卵裂细胞、绒毛和羊水中的胎儿脱落细胞进行产前的染色体诊断
    • 细胞遗传学检查适应指征
      • 智能发育不全、生长迟缓或伴有其他先天畸形者
      • 夫妇中有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等
      • 家族中已发现染色体异常或先天畸形个体
      • 多发性流产的妇女及其丈夫
      • 原发闭经和男女不育不孕症者
      • 35岁以上的高龄孕妇
      • 有两性内外生殖器畸形者
  • 性染色质检查
    • 性染色质检查包括X染色质和Y染色质检查，主要用于疑为两性畸形或性染色体数目异常疾病的诊断或产前诊断
    • 分类
      • Ｘ性染色质检查
      • Ｙ性染色质检查
  • 荧光原位杂交技术
    • 荧光原位杂交（FISH）应用不同荧光颜色标记的多种特异性DNA探针与玻片上的细胞中期染色体或间期核的DNA进行原位杂交即可完成检测，染色体中期FISH还可检测染色体微小缺失、插入、易位、倒位或扩增等结构异常
    • 特点
      • 应用已知核酸序列作为探针，检测结果更客观、准确、可靠
      • 既可以检测中期分裂相又可检测间期细胞核
      • 可以识别常规染色体分析不能识别的标记染色体，明确标记染色体的性质
      • 只能用特异的探针检测已知的染色体异常
      • 一种探针往往只能检测出一种异常
    • 多色FISH：采用5种荧光素不同的组合同时标记24种人类染色体
  • 微列阵比较基因杂交技术（aCGH ）
    • 通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品（病例样品和对照样品）进行共杂交，可检测样本基因组相对于对照基因组的DNA拷贝数变化
    • 特点
      • 灵敏度高、精确性好
      • 自动化、程序化
• 蛋白质水平诊断
  • 遗传病的蛋白质水平诊断又称为遗传病的生物化学检查，可对酶和蛋白质进行定性和定量分析，还包括对反应底物、中间产物、终产物和受体与配体的检查，可反映基因变异，是遗传病诊断中的重要辅助手段
  • 包括一般的临床生化检验和遗传病的特异检查
  • 针对不同类型遗传病缺陷的不同，采用的生化检查方法也不相同
    • 酶变异型分析：电泳速率、酶动力学、指纹分析和免疫反应
    • 蛋白质变性分析：电泳技术、肽链和氨基酸序列分析
  • 产前诊断：绒毛、羊水、脐带血、胎儿皮肤
  • 新生儿的筛查：血、尿
• 基因诊断
  • 特点
    • 又称分子诊断，指利用分子生物学技术，直接检测DNA或RNA在结构或表达水平的变化，从而对疾病做出诊断
    • 基因诊断可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因而作出诊断，故基因诊断又称为逆向诊断
    • 症状前诊断：外周静脉血
    • 产前诊断
      • 孕早期的绒毛细胞
      • 孕中期的羊水胎儿脱落细胞
      • 脐带血
      • 母亲外周血中的胎儿有核红细胞
    • 植入前诊断：受精卵卵裂细胞
  • 基本途径及常用方法
    • 直接诊断
      • 直接诊断指直接检测致病基因本身的异常，通常使用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，探查基因有无突变、缺失等异常及其性质
      • 适用于已知基因异常的疾病诊断
      • 指征
        • 致病基因明确的单基因遗传病
        • 患者群体致病基因突变谱已建立，有突变热点
        • 基因较小，检测时间与成本符合临床需要
      • 方式
        • PCR及相关技术
          • PCR技术检查
            • PCR是模拟体内DNA的天然复制过程，在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术
            • 在待扩增DNA片段两侧，设计一对寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，可使目的DNA片段以指数方式增加
            • Barts胎儿水肿
          • PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）
            • 应用单链DNA因其碱基序列不同，会形成不同构象从而导致电泳的泳动速度改变，形成电泳泳动变位来检测有无碱基改变的技术
          • PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）
            • 由于DNA序列的变异所引起的限制性酶切位点的改变，从而导致酶切片段大小的差异。这些片段在人群中呈多态现象
            • 镰状细胞贫血（HbS）
            • 软骨发育不全（ACH）
          • PCR-多重连接探针扩增（PCR-MLPA）
            • 一种针对待测DNA靶序列进行定性和半定量分析的方法，在一次反应中可以同时检测多个不同核苷酸序列的拷贝数变化，具有通量高、特异性好的优势，可用于检测大的片段缺失、重复
        • 分子杂交
          • 分子杂交是根据碱基互补配对原理，利用标记探针鉴定密切相关核酸序列的分子方法
          • 分子杂交是最早用于基因诊断检测遗传病基因缺陷的手段
          • 方法
            • Southern印迹（Southern blot）
            • Northern印迹（Northern blot）
            • 斑点印迹（dot blot）
          • 镰状细胞贫血（HbS）
        • Sanger测序
          • DNA序列测定时诊断已知或未知基因突变最直接可靠的方法，是基因诊断的”金标准”。双脱氧链终止法，也称一代测序
          • 可以用于点突变、小的插入和缺失等检测
          • 优点：阅读DNA片段长、精确度高
          • 缺点：通量低，测序成本高
        • 高通量测序技术
          • 又称二代测序（NGS），可检测整个基因组存在的点突变、插入及缺失等，免去了DNA片段克隆和毛细管电泳，产生宏量的序列信息，分析速度快捷且分析成本明显降低。可以检测整个基因组点突变、插入、缺失
          • 原理：边合成边测序
            • 目标DNA剪切为小片段
            • 单个小片段DNA结合到固相表面
            • 单分子独立扩增
            • 每次只复制一个碱基并检测信号
            • 高分辨率成像系统
        • 基因芯片技术
          • 基因芯片（DNA chip）的测序原理是杂交测序，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交来进行核酸序列测定的方法。一次对样品大量的序列进行检测分析，较传统的分子杂交先进
          • 特点：高效、敏感、高通量
        • 等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）
          • 检测单碱基或几个碱基的突变或小插入、缺失突变的最佳探针是合成的寡核苷酸，其长度短，灵敏度高，甚至可以精确到探针和标本之间单个碱基的错配
          • 人工合成的等位基因特异性寡核苷酸一般用于检测已知的点突变，通常需要合成两种探针，正常型和突变型探针
    • 间接诊断
      • 间接诊断所针对的情况是当致病基因已知而突变未知时，或致病基因本身尚属未知时，通过对受检者及家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体
      • 连锁分析法
        • 应用与待检测基因紧密连锁的遗传标记，结合家系分析进行基因诊断。
        • RFLP：苯丙酮尿症，PKUⅠ
        • RFLP：血友病A
      • PCR-短串联重复序列分析（PCR-STR）
        • 应用PCR技术扩增与待检测基因紧密连锁的STR遗传标记，结合家系分析进行基因诊断
      • 全基因组关联分析（GWAS）
        • 利用基因组中的单核苷酸多态性（SNP）作为分子遗传标记，进行全基因组水平的对照分析或相关性分析，寻找与复杂疾病相关的遗传因素
        • 两阶段法
          • 第一阶段：全基因组SNP病例对照分析→候选阳性SNP
          • 第二阶段：更大数量病例的对照组验证候选SNP→疾病相关SNP
    • 基因突变预筛查
      • 变性高效液相色谱（DHPLC）
        • 一种杂合双链突变检测技术，自动检测单碱基替代以及小片段核苷酸的插入或缺失
        • 基本原理
          • 将工作温度 (柱温 )升高使DNA片段开始变性，部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链 (错配的 ) DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。
      • 高分辨率熔解曲线（HRM）
        • 用于突变扫描和基因分型的一种PCR后分析方法
        • 优点
          • 操作简单，分析时间短，灵敏度和特异性高
          • 闭管操作
          • 低试剂消耗量，低废物率
          • 低样本消耗
          • 高通量,适合大量样品的分析
        • 了解
          • 在PCR反应前加入饱和荧光染料，PCR结束后检测仪器在一定的温度范围内将PCR产物进行变性，使DNA双链逐渐解链，染料分子逐渐从DNA双链上脱落，荧光信号下降
          • 个体携带杂合变异，PCR产物中会存在异源双链，温度升高时会先解开，荧光染料会被释放，荧光信号下降；纯合个体的样本由于解链温度高，荧光信号下降相对较慢
          • 仪器光学检测系统通过采集荧光信号绘制出熔解曲线，通过比较检测个体与对照者扩增片段的熔解温度及熔解曲线的差异判读结果
• 产前诊断
  • 总论
    • 产前诊断是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作出的诊断，是预防遗传病患儿出生的有效手段
    • 在遗传咨询的基础上，对有高风险的妊娠进行产前诊断，可为遗传病风险家庭提供充足可靠的信息，使他们在妊娠期做出适当的选择
    • 可以进行产前诊断的遗传病
      • 染色体病
      • 特定酶缺陷所致的遗传代谢病
      • 可进行DNA检测的某些遗传病
      • 神经管缺陷（NTD）
      • 有明显形态改变的先天畸形
  • 对象
    • 35岁以上的高龄孕妇
    • 曾生育过染色体异常患儿的孕妇
    • 夫妇一方有染色体数目或结构异常，特别是表型正常的染色体平衡易位/倒位携带者
    • 夫妇一方有先天性代谢缺陷或生育过这种患儿的孕妇
    • 曾生育过无脑儿、脑积水、脊柱裂等神经管缺陷儿的孕妇
    • 孕妇为严重的X连锁隐性遗传病携带者
    • 原因不明的多次流产、死胎、死产或生育过多发畸形儿的孕妇
    • 夫妇一方有明显的致畸因素接触史或孕早期病毒感染，服用不当药物的孕妇
  • 方法
    • 有创性方法
      • 羊膜穿刺
      • 绒毛取样
      • 脐带穿刺
      • 胎儿镜检查
    • 无创性方法
      • B超检查
      • X线检查
      • 孕妇外周血分离胎儿细胞
      • 孕妇外周血胎儿游离DNA/RNA检查
    • 胚胎植入前遗传学诊断（PGD）
      • 体外受精胚胎发育卵裂阶段对遗传性疾病进行诊断的一种方法
      • 可以开展PGD的遗传病
        • 单基因病
        • 动态突变引起的疾病
        • 染色体病