导图社区 流式分选注意要点
详细介绍了流式分选的样本准备、分选过程以及机器维护的注意事项。根据线上讲座整理。
介绍了10x genomics测序数据的一般分析流程、大纲。根据基迪奥《单细胞测序完全解析》整理。
介绍了NKG2D分子是什么、表达范围,肿瘤通过NKG2D/NKG2DL逃逸免疫反应的机制。根据一篇关于NKG2D的综述整理。
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流式分选注意要点
样品准备
预先磁珠富集
缩短分选时间
提高细胞活力
保证纯度
冲突events减少
排除死细胞
DNA染料,无细胞毒性
避免堵
无酶消化制备样本
阻断样本中胰酶
DNAseI
过滤
合理使用对照
圈门
细胞重悬
推荐PBS
加少量血清(不超过2%)、EDTA
不推荐直接使用培养基
结晶
酚红
激光折射
需要5%CO2保证pH
含Ca2+、Mg2+,增加粘性
可使用无血清培养基
重悬浓度:
2-3E7/ml
大细胞:5-8E6/ml
高质上机
较低液流压力
否则影响荧光、细胞活力
70um: 2E4/s
85um:0.8-1E4/s
阈值设定
小于阈值信号不作为events记录
排除无关细胞,效率会提高
但可能收到更多碎片
干扰后续实验
培养
DNA
RNA
避免使用直方图
掩盖信息
液滴调试
落在管底中央,否则
细胞干在管壁上
碎片
得率
细胞碎在管壁上
收集管
FBS包管
聚丙烯材质优于聚苯乙烯
细胞黏附
累积静电
管底含2-10%血清的buffer
长时间上机
培养基加HEPES
细胞分层,及时混匀
累积静电,影响液滴偏转,及时换管子
纯度回测
关注每一个门的纯度而非最终门
机器
开机先做CST
激光稳定
鞘液至少100um过滤
颗粒影响,如外泌体分选
无菌
1.鞘液、样品:2%HCLO 2h上样
2.无菌水跑2h
3.酒精走关机程序
4.鞘液桶酒精熏蒸过夜
5.换成高压后的鞘液正常上机
上样前
1.酒精2-3min
2.无菌水,或blackflush
关机前clean,rinse交替3-5次再关机
分选仓
分选前、后用沾水棉签反复擦
手套勤喷酒精
管口污染
分选仓外、仪器周边
勤擦尘,防飘分选区
细胞活性
鞘液质量,如pH
喷嘴尺寸
目的targets的4-5倍
合适流速
激光功率
能够辨别阴阳信号的最低功率
不是电压,有些机器可调
温度
环境:18-22℃
上样区4℃
收集区4℃冷水循环