细胞生物学研究方法知识点总结

【细胞生物学】细胞生物学研究方法知识点总结：细胞形态结构的观察方法：通过光栅的旋转可移动将多重相互衍射的光束照射到样本上，并在此发生干涉；从收集到的发射光模式中提取高分辨信息，生成一副完整的图像。

【细胞生物学】02-细胞生物学研究方法知识点总结

• 生命科学的发展趋势
  • 基本单元
    • 基因
      • 蛋白
        • 细胞器
  • 功能体现
    • 基因网络
      • 蛋白互作网络
        • 细胞器互作网络
  • 细胞生命活动
• 细胞形态结构的观察方法
  • 肉眼
    • 分辨率：0.2mm
  • 光学显微镜
    • 普通复式光学显微镜
      • 组成部分
        • 光学放大系统
          • 目镜+物镜
        • 照明系统
          • 光源+聚光镜
        • 镜架及样品调节系统
      • 最重要的性能参数
        • 分辨率D
          • 能区分开两个质点间的最小距离
            • * 越小越好
          • D=0.61λ / N·sin(α/2)
            • * λ：光源的波长 * α：物镜镜口角 * N：介质折射率
      • 最大分辨率
        • 0.2um
      • 用途
        • 直接观察单细胞生物或体外培养细胞
        • 观察生物组织样品
          • 取材
          • 固定（甲醛）
          • 包埋（石蜡）
          • 切片（5um左右）
          • 染色（H-E染色，即苏木精-伊红染色）
            • * 碱性苏木精染细胞核成分，酸性伊红染细胞质成分
          • 观察
    • 相差显微镜和微分干涉显微镜
      • 相差显微镜
        • 利用相干光的干涉，增强样品的反差（衬度），不通过染色，观察活细胞显微结构的细节
        • 通过明暗区分密度不同的区域
      • 微分干涉显微镜
        • 同上，以平面偏振光为光源
        • 更适于研究活细胞
        • +高分辨率录像装置
          • 观察记录活细胞中的颗粒及细胞器的运动
        • +计算机辅助
          • 分辨率提高一个数量级
            • * 可观察单根微管（24nm）
          • 录像曾差显微镜
            • * 可观察颗粒物质沿微管运输的动态过程
    • 荧光显微镜
      • 在光镜水平上，对细胞内特异的物质组分进行定性定位研究的工具
      • 原理
        • 激发光（短波）
          • 内源性荧光物质或荧光染料
            • * 荧光（长波） * 滤光片（只透过激发光）
        • 提供了强反差背景，非常微弱的荧光信号也可以分辨
      • 样品制备技术
        • 免疫荧光技术
        • 荧光素直接标记技术
          • eg：DAPI可特异性结合DNA
    • 激光扫描共焦显微镜
      • 激光成像系统+荧光显微镜
      • 过滤了焦平面以外的散射光，大大提高了图像的分辨率
      • 通过调整焦平面，可进行逐点、逐行、逐面扫描
        • 可通过“光学切片”重构出样品的三维结构
    • 超高分辨率显微术
      • 全内反射荧光显微术
        • 原理
          • 通过全反射产生的隐失波激发荧光
          • 因为隐失波在z轴呈指数衰减，只会激发约100nm厚度的荧光，从而降低背景噪声干扰
        • 只能观察细胞紧靠玻片100nm的范围
      • 基于单分子成像技术的PALM/STORM方法
        • PALM（光激活定位显微术）
          • 原理
            • * PA-GFP在激活前对488nm激光无反应，用405nm激光激活后可在488nm激光下发出绿色荧光
          • 步骤
            • * 将目的蛋白克隆到PA-GFP表达载体，并转染细胞 * 融合蛋白表达 * 用较低能量的405nm激光照射细胞 * 随机使很少一部分（相隔较远的）PA-GFP激活 * 用488nm激光激发激活的PA-GFP * 通过高斯函数拟合将这些荧光分子定位 * 用488nm激光将已精确定位的荧光分子漂白 * 重复上述循环数百次 * 将细胞内几乎所有荧光分子分批次精确定位
          • 缺点
            • * 只能用于观察外源表达蛋白的定位 * 每一幅图像照相所需时间很长，不适合用于活细胞动态观察
        • STORM（随即光学重构显微术）
          • 原理
            • * 花青染料可以被一种波长的光激活发出荧光，可以被另一种波长的光关闭而处于暗态
          • 步骤
            • * 将原本靠得很紧的蛋白质用成对的染料（如Cy3/Cy5）标记的特异抗体反应 * 先用激光使报告分子Cy5失活 * 用561nm激光随机激活少数几个Cy3 * 导致其配对的Cy5活化 * 用647nm激光激发Cy5 * 通过高斯拟合定位其位置 * 重复上述过程10000次以上
          • 缺点
            • * 得到一张超分辨图像的时间很长，在活细胞中很难实现
      • 4π和STED显微术
        • 4π
          • 原理
            • * 增加物镜的接受角而等效增加物镜的数值孔径
          • 操作
            • * 在样品的两侧各放置一个相同的高性能物镜
          • 优点
            • * 大大提高了z轴的分辨率
        • STED（受激发射损耗显微术）
          • 原理
            • * 使用一束激光，仅激发一个点的荧光基团并使其发出荧光 * 用第二束像面包圈一样的环状高强度脉冲激光照射那个点周围的荧光 * 使发光物质从受激状态返回基态 * 实现只有中间没有完全损耗的英冠分子可以观察到
          • 优点
            • * 使水平面的分辨率达到纳米级 * 可以快速观察或细胞内的实时动态变化
          • 缺点
            • * 没有提高z轴方向的分辨率
      • 结构照明显微术（SIM）
        • 原理
          • 通过光栅的旋转可移动将多重相互衍射的光束照射到样本上，并在此发生干涉
          • 从收集到的发射光模式中提取高分辨信息，生成一副完整的图像
        • 优点
          • 对于普通的免疫荧光标记样本和荧光蛋白表达样本，可以不经特殊处理直接观察
        • 缺点
          • 分辨率远低于其他超高分辨率显微术
  • 电子显微镜
    • 电子显微镜的基本知识
      • 电子显微镜与光学显微镜的基本区别
        • 最佳分辨率
          • 光镜：200nm
          • 电镜：0.2nm
            • * 常受制样技术本身的限制，实际分辨率要更低
        • 光源
          • 光镜：可见光（400-760nm）
          • 电镜：电子束（0.01-0.9nm）
        • 透镜
          • 光镜：玻璃透镜
          • 电镜：电磁透镜
        • 真空
          • 光镜：无需真空
          • 电镜：需真空
        • 放大倍数
          • 光镜：1000倍
          • 电镜：百万倍
        • 成像原理
          • 光镜：样品对光吸收形成的明暗反差和颜色变化
          • 电镜：样品对电子的散射和投射形成明暗反差
      • 电子显微镜的基本构造
        • 电子束照明系统
          • 电子枪
          • 聚光镜
        • 成像系统
          • 物镜、中间镜、投影镜等
          • 中空圆柱体，里面装置线圈，调节电子束运动
        • 真空系统
        • 记录系统
      • 电子显微镜无法观察活的生物样品，且难以观察细胞的全貌
    • 主要电镜制样技术
      • 超薄切片技术
        • 切片厚度一半为40-50nm，仅细胞直径数百分之一
        • 步骤
          • 固定
            • * 保持样品的形态和精细结构不发生改变，有时还要求细胞内部的成分保持在原来的位置上，甚至其免疫原性尽可能不发生改变 * 常用方法 * 化学法 * 戊二醛、四氧化锇（锇酸）、高锰酸钾 * 物理法 * 超低温冷冻 * 操作要点 * 动物处死和取材都要快速进行 * 防止细胞自溶作用造成的损伤 * 固定的样品块直径一般小于1mm * 便于固定剂迅速渗透
          • 包埋
            • * 保证在切片过程中，包埋介质能均匀良好地支撑样品 * 包埋介质要求 * 具有良好的机械性能 * 利于切片 * 在聚合过程中，不能发生明显的膨胀与收缩 * 易被电子穿透并能耐受电子的轰击 * 在高倍放大的图像中不显示本身结构 * 常用环氧树脂 * 包埋前要经过一系列脱水处理
          • 切片
            • * 切片须捞在覆有支持膜（如Formvar膜）的载网（铜网或镍网）上，用于染色和电镜观察
          • 染色
            • * 用重金属盐染色 * 不同染料的性质 * 锇酸宜染脂质 * 柠檬酸铅宜染蛋白质 * 乙酸双氧铀宜染核酸 * “染色”原理 * 电子束穿过样品时，样品中的金属离子不同程度的散射和吸收电子
      • 负染色技术
        • 原理
          • 用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色，吸去多余染料，样品自然干燥后，整个载网上都铺了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构
        • 应用
          • 观察经纯化的细胞组分或结构、病毒
      • 冷冻蚀刻技术
        • 步骤
          • 冰冻断裂
            • * 快速低温冷冻法 * 液氮或液氦 * 在低温下进行断裂 * 样品往往从结构相对“脆弱”的部位断裂 * 膜脂双分子层的疏水端 * 显示出镶嵌在膜脂中的蛋白质颗粒
          • 蚀刻复型
            • * 经过一段时间的冰升华（蚀刻） * 用铂等重金属进行倾斜喷镀 * 用碳进行垂直喷镀 * 用消化液把生物样品消化掉 * 将复型膜转移到载网上，电镜观察
        • 应用
          • 主要用来观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征
        • 优点
          • 图像富有立体感
          • 样品不需包埋，甚至不需固定
            • * 更好地保持样品的真实结构
      • 电镜三维重构与低温电镜技术
        • 电镜图像的三维重构
          • 从二维电镜图像出发，构建出样品的三维图像
          • 投射电镜含有样品的内部信息
        • 低温电镜技术
          • 应用
            • * 细胞内各种生物大分子及其复合物的三维结构分析
          • 不经过固定、包埋、染色、干燥等步骤
          • 将样品在冷冻剂中快速冷冻，得到100-300nm厚的冰膜，在电镜内-160℃低温下利用相位衬度成像
        • 低温电镜单颗粒分析技术
          • 对包被在冰膜中相同的的、分散的、取向随机性的大量颗粒性样品进行拍照和三维重构处理
          • 最主要、发展最快的电镜三维重构方法
          • 接近原子尺度的分辨率
        • 电子断层成像技术
          • 对样品中同一物体，在不同的倾角下连续拍照
          • 分辨率稍低，但可用于更大尺度的细胞器、细胞骨架、膜泡运输系统等的三维应用研究
        • 扫描电镜背散射成像
          • 应用
            • * 研究细胞、组织等更大尺度的超微结构的三维结构
      • 扫描电镜技术
        • 原理
          • 极细电子束
          • 激发次级电子
          • 收集、分析次级电子的量（明暗）
          • 获得样品表面的立体图像信息
        • 操作要求
          • 需要利用CO2临界点干燥法对样品进行干燥处理
            • * 保证样品在扫描观察前不发生表面变形
          • 样品在观察前要喷镀一层金膜
            • * 得到正确的二次电子信号
  • 扫描隧道显微镜
    • 原理
      • 量子力学中的隧道效应
        • 通过样品和针尖间的电流大小确定两者的距离
    • 主要特点
      • 拥有原子尺度的高分辨本领
      • 可以在真空、大气、液体等多种条件下工作
      • 非破坏性测量
• 细胞及其组分的分析方法
  • 用超离心技术分离细胞组分
    • 破碎细胞
      • 低渗匀浆、超声波破碎、研磨
    • 差速离心
      • 特点
        • 介质密度均一
        • 速度由低向高，逐级离心
      • 沉降顺序
        • 核
          • 线粒体
            • * 溶酶体与过氧化物酶体 * 内质网、高尔基体 * 核糖体
      • 常需密度梯度离心进一步分离纯化
    • 密度梯度离心
      • 介质
        • 氯化铯、蔗糖
      • 各组分的沉降率以沉降系数（S值）表示
      • 分类
        • 速度沉降
          • 用于分离密度相近而大小不一的细胞组分
        • 等密度沉降
          • 用于分离不同密度的细胞组分
  • 特异蛋白抗原的定位与定性
    • 体内
      • 免疫荧光技术
        • 免疫学方法+荧光标记技术
          • 还可用酶代替荧光分子与抗体偶联
        • 分类
          • 直接免疫荧光技术
            • * 荧光分子与抗体偶联
          • 间接免疫荧光技术
            • * 第一抗体与抗原反应，第二抗体（第一抗体的抗体）与荧光分子偶联
        • 步骤
          • 荧光抗体的制备
          • 标本的处理
            • * 组织切片、冷冻切片、整装细胞 * 尽量完好地保持被检测蛋白的抗原性
          • 免疫染色
          • 观察记录
        • 优点
          • 快速、灵敏、特异性强
        • 缺点
          • 分辨率有限
      • 免疫电镜技术
        • 分类
          • 免疫铁蛋白技术
          • 免疫酶标技术
          • 免疫胶体金技术
            • * 优点 * 电镜下金颗粒容易识别 * 可以制成不同直径的金颗粒 * 用以双重标记或多重标记
        • 样品制备
          • 固定
          • 包埋
          • 超薄切片制备
          • 免疫标记
          • 染色
        • 技术关键
          • 样品制备中既要保持样品中蛋白的抗原性，又要尽量保存样品的精细结构
    • 体外
      • 免疫印迹（western blotting）
  • 细胞内特异核酸的定位与定性
    • 分子杂交技术
      • DNA印记（southern blotting）
      • RNA印记（northern blotting）
    • 原位杂交技术
      • 标记的核酸探针确定特异核苷酸序列的位置
      • 标记物
        • 放射性同位素+放射自显影
        • 荧光素+荧光显微镜
        • 生物素
        • 与抗生素抗体相连的胶体金颗粒+电镜
      • 应用
        • 在显微与亚显微水平上研究基因定位、特异mRNA表达等问题
  • 细胞成分的分析与细胞分选技术
    • 流式细胞术
      • 应用
        • 定量地测量某一细胞中的DNA、RNA、某一特异的标记蛋白的含量
        • 细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量
        • 将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来
        • 将DNA含量不同的中期染色体分离出来
        • 细胞的分选
      • 原理
        • 细胞在经过激光时会根据胞内物质携带不同电荷，在随后的电场中发生不同偏转
  • 细胞组分的化学显示方法
    • 多糖
      • PAS反应
    • DNA
      • Feulgen反应
    • 蛋白质
      • 茚三酮反应
  • 三种印记的区别
    • 实验对象
      • sb：DNA
      • nb：mRNA
      • wb：蛋白质
    • 凝胶电泳种类
      • sb：琼脂糖凝胶
      • nb：甲醛琼脂糖凝胶
      • wb：聚丙烯酰胺凝胶
    • 分离方法
      • sb：毛细迁移
      • nb：毛细迁移
      • wb：电迁移
    • 探针
      • sb：DNA 放射性或非放射性同位素
      • nb：cDNA/cRNA 放射性或非放射性同位素
      • wb：第一抗体
• 细胞培养与细胞工程
  • 细胞培养
    • 动物细胞培养
      • 原代细胞
        • 从集体取出后立即培养的细胞
        • 培养步骤（单层细胞培养）
          • 取出健康动物的组织块，剪碎
          • 用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与EDTA等将细胞连接处消化使其分散
          • 给予良好的营养液与无菌环境
            • * 一定要加一定量的小牛或胎牛血清 * 便于细胞贴壁生长和分裂
          • 在培养中进行静置或慢速转动培养
      • 传代细胞
        • 进行传代培养后的细胞
        • 原代培养的细胞一般传至10代就难以传代了
          • 细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡
          • 少数细胞能继续传40-50代
            • * 仍旧保持二倍体数量及接触抑制行为
          • 极少数细胞获得突变，能够无限传代培养
        • 某些传代细胞可用悬浮方法培养
          • 在有限的培养液中获得大量细胞
      • 细胞系
        • 从培养细胞中筛选出的细胞群
        • 分类
          • 有限细胞系
            • * 常为二倍体细胞
          • 永生细胞系/连续细胞系
            • * 亚二倍体或非整倍体 * 失去接触抑制
      • 细胞株
        • 由同一祖先细胞克隆得到的细胞群体
        • 具有特殊的遗传标记或性质
      • 体外培养的细胞一般不能保持其原有的细胞形态
        • 成纤维样细胞
        • 上皮样细胞
    • 植物细胞培养
      • 细胞培养
        • 常用单倍体细胞培养
          • 花药离体培养
      • 原生质体培养
        • 常用去除细胞壁的体细胞培养
  • 细胞工程
    • 细胞融合与单克隆抗体技术
      • 细胞融合
        • 两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象
        • 介导物质
          • 灭活的病毒
            • * 仙台病毒 * 副流感病毒 * 新城鸡瘟病毒
          • 化学物质
            • * 聚乙二醇（PEG）
          • 物理方法
            • * 高压电脉冲处理 * 激光处理
        • 根据基因型相同/不同
          • 同核体
          • 异核体
      • 单克隆抗体
        • 浆细胞+骨髓瘤细胞
        • 优点
          • 可以用混合性的异质抗原制备出针对某一单一性抗原分子上特定决定簇的同质性单克隆抗体
    • 显微操作技术与动物的克隆
      • 细胞拆合技术
        • 把细胞核和细胞质分离开来，把不同源的胞质体和核质体相互组合，形成核质杂交细胞
        • 方法
          • 物理法
            • * 用机械方法或短波光把细胞核去掉或使之失活 * 用微吸管吸取其他细胞的核，注入去核的细胞质中 * 必须用显微操纵仪进行操作
          • 化学法
            • * 用细胞松弛素B处理 * 细胞出现排核现象 * 离心 * 将细胞拆分为核质体和胞质体两部分
• 细胞及生物大分子的动态变化
  • 荧光漂白恢复技术
    • 使用亲脂性或亲水性的荧光分子，与蛋白质或脂质偶联
    • 用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及迁移速率
    • 原理
      • 利用高能激光束照射细胞的某一特定区域
        • 该区域内标记的荧光分子发生不可逆的淬灭
        • 光漂白区
      • 由于细胞中脂质分子或蛋白质分子的运动。周围非漂白区的荧光分子不断向漂白区迁移
        • 使光漂白区的荧光强度逐渐恢复原有水平
  • 酵母双杂交技术
    • 在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的系统
    • 转录激活因子包含两个结构域
      • DNA结合域（DB）
      • 转录激活域（AD）
    • 若要证明蛋白A与B在细胞内能否发生相互作用
      • DB+蛋白A
      • AD+蛋白B
      • 若A、B能相互结合，则其融合的DB和AD能结合，启动报告基因的表达
  • 荧光共振能量转移技术
    • 检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用
    • 原理
      • 一定波长的激发光→基团A→荧光A→近距离的基团B→荧光B
      • 若要证明蛋白A与B在细胞内能否发生相互作用
        • 基团A+蛋白A
        • 基团B+蛋白B
        • 若A、B能相互结合，则在激发光下可以检测到荧光B
          • 荧光B的强度可显示二者互作的强弱
  • 放射自显影技术
    • 利用放射性同位素的电离射线对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术
    • 能对细胞或生物体内生物大分子进行动态研究和追踪
    • 步骤
      • 同位素标记的生物大分子前体的掺入
      • 细胞内同位素所在位置的显示
• 模式生物与功能基因组的研究