基因重组与重组DNA技术

参照复旦大学出版社出版的《生物化学与分子生物学》整理，同源重组指发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。

基因重组与重组DNA技术

• 自然界DNA重组的方式
  • 同源重组
    • 发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换
    • 步骤
      • DNA两条链平行排列
      • 其中一条单链断裂，侵入另一条DNA双链并与对应的链连接，形成Holliday中间体
      • 通过分支移动产生异源双链DNA
      • 中间DNA通过剪切再连接形成两个双链重组体DNA
    • 根据切开方式不同
      • 片段重组体：切开的链是最初断裂的链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA
      • 拼接重组体：切开的链不是原来断裂的链，重组体异源双链区两侧来自不同的亲本DNA
    • 大肠埃希菌同源重组关键酶
      • RecBCD复合物使得DNA产生单链缺口
      • RecA介导被切断的DNA单链侵入另一条DNA双链，并与其中一条链交叉，交叉分支移动，待相交的另一链经RecBCD内切酶催化而断裂
      • DNA连接酶连接缺口，形成Holliday中间体
      • RuvC切割中间体，DNA连接酶作用完成重组
  • 位点特异性重组
    • λ噬菌体DNA的整合
      • λ噬菌体整合酶Int识别噬菌体DNA重组位点att P与宿主大肠埃希菌的重组位点att B之间的特异性靶位点
      • 在整合酶，整合宿主因子IHF作用下发生选择性整合
      • Xis蛋白参与切除过程
    • 反转录病毒的整合
      • 借助反转录病毒整合酶特异性识别长末端重复序列，来完成整合
    • 细菌的特异位点重组
      • 鼠伤寒沙门杆菌的鞭毛蛋白根据H抗原不同，可分为H1和H2两种
      • H片段两个启动子
        • 一个编码H2和rH1蛋白
        • 一个编码hin蛋白
      • 启动子驱动H2时，H2表达，rH1表达从而抑制H1的表达
      • hin编码倒位酶Hin，可结合在14bp特异重组位点hix上，并由辅助因子Fis促使DNA弯曲而将两Hix位点连接在一起，DNA片段经过断位再连接发生断裂
      • 倒位酶作用使得H2和rH1不表达，从而H1得以表达，表现为H1鞭毛
    • 免疫球蛋白基因的重排
      • 免疫球蛋白
        • 组成
          • 两条重链，由一个基因簇编码
          • 两条轻链，由两个基因簇（κ和λ）编码
        • 轻链基因簇
          • L（前导片段）；V（可变片段）；J（连接片段）；C（恒定片段）
        • 重链基因簇
          • L（前导片段）；V（可变片段）；D（多样性片段）；J（连接片段）；C（恒定片段）
        • 参与轻链和重链的重组酶有两个
          • RAG1：识别RSS上特异性序列（富含A的9核苷酸序列）
          • RAG2：与RAG1结合，二者的复合物对切割位点（7核苷酸回文序列）进行切割
        • V片段上游、D片段两侧，J片段下游均有保守的重组信号序列RSS
          • 识别序列（富含A的9核苷酸序列）
          • 切割位点（7核苷酸回文序列）
      • T细胞受体
        • αβ受体：位于成熟T细胞，主要的T细胞受体
          • β链有V-D-J连接
          • γ链有V-J连接
        • γδ受体：位于不成熟T细胞，或者缺失αβ链的T细胞
  • 转座重组
    • 插入序列转座
      • 插入序列
        • 位于两端的反向重复序列IR
        • 中间的转座酶编码基因
      • 转座由转座酶催化完成
      • 插入序列发生转座的三种形式
        • 保守性转座：插入序列从原位迁移到新位
        • 复制性转座：插入序列迁移到新位的同时原位上又生成一段跟之前一样的序列
        • 非复制性转座：插入序列离去后，早原位留下一段缺口
    • 转座子转座
      • 其中含有一段有抗生素抗性等有用的基因，其余与插入序列转座相同
  • 原核生物的多种基因转移的方式
    • 接合作用
      • 细胞或细菌通过菌毛相互接触，质粒DNA从一个细胞转移至另一个细胞
      • F因子含有细菌性鞭毛蛋白编码基因，决定细胞表面性鞭毛的形成
      • 含有F因子的细菌与不含有F因子的细菌相遇时，性鞭毛会在两个细胞之间结合，接着质粒双链DNA中的一条链被切断，产生单链切口，单链DNA通过鞭毛连接桥向F-细胞转移
      • 随后，在两个细胞内分别以单链DNA为模板合成互补DNA
    • 转化作用
      • 通过主动获取或人为外源供给DNA，使宿主细胞获得新的遗传表型
      • 溶菌时释放的裂解DNA片段作为外源性的DNA被另一个细菌获取，并通过重组将外源DNA整合进基因组
      • 较大的外源性DNA不易透过细胞膜，因此自然界发生的转化作用并不显著，染色体整合概率则更低，实验室常通过物理和化学的方法使受体菌通透性增加成为感受态细胞
    • 转导作用
      • 当病毒从细胞中释放出来后，再次感染另一个细胞时，发生在供体细胞核受体细胞之间的DNA转移及基因重组
      • 普遍性转导
        • 细菌被感染后裂解后的病毒颗粒包裹有供体菌自身DNA，释放的噬菌体通过感染受体菌而将所携带的DNA片段转移到受体菌种
      • 特异性转导
        • 病毒的基因组在感染细菌后被特异性插入到细菌的DNA中，在溶菌时，整合的噬菌体从供体菌DNA上切离，可携带位于整合位点侧翼的DNA片段，病毒感染新的细菌后将位于整合位点侧翼的供体菌DNA片段重组到受体菌DNA特异性位点上
• 重组DNA技术
  • 基本概念与原理
    • DNA克隆
      • 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合
      • 克隆化：获取同一拷贝的过程
      • 分子克隆：专指应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质、同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆
    • 重组DNA技术
      • 实现DNA克隆所采用的方法及相关的工作统称重组DNA技术
    • 目的基因
      • 应用重组DNA技术的目的是为了分离并获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达产物——蛋白质，这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因
      • 目的基因
        • cDNA
          • 经过反转录合成的、与RNA（通常指mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA,以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA
        • 基因组DNA
          • 来源于一个细胞或生物体染色体或线粒体的DNA序列
  • 常用工具酶
    • 限制性核酸内切酶
      • 识别特异序列，准确切割DNA
      • 限制性核酸内切酶和甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰体系，对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义
      • 常用的限制性核酸内切酶为II型，具有较强的特异性，可以识别的位点呈现二元对称，称为回文序列
      • 同尾酶：有的限制性核酸内切酶虽然识别序列不完全相同，但是切割DNA后产生相同类型的黏性末端，这样的酶称为同尾酶，所产生的黏性末端称为配伍末端，可进行相互连接
      • 产生平端的酶切割DNA后，也可彼此连接
    • DNA连接酶
      • 催化DNA中相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，封闭DNA缺口或连接两个DNA分子
    • DNA聚合酶I
      • 合成双链cDNA分子或片段连接
      • 缺口平移制作高比活探针
      • DNA序列分析
      • 填补3'末端
    • Klenow片段
      • DNA聚合酶I的大片段
      • cDNA第二链的合成，双链cDNA3'端标记
    • 逆转录酶
      • cDNA第1链的合成
      • 替代DNA聚合酶I进行填补、标记、以及DNA序列分析
    • 多聚核苷酸激酶
      • 催化多聚核苷酸5'端羟基磷酸化
      • 标记探针
    • 末端转移酶
      • 在3'末端进行同质多聚物加尾
    • 碱性磷酸酶
      • 切除末端磷酸键
  • 常用载体
    • 克隆载体
      • 质粒
        • 存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子
        • 质粒本身能在宿主细胞中独立自主进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子细胞
        • 质粒本身带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状，如对青霉素或重金属的抗性，可用于筛选转化子细菌
      • 噬菌体DNA
        • λ噬菌体
          • λgt系列——插入型载体，适用于cDNA克隆
          • EMBL系列——置换型载体，适用于基因组克隆
        • M13载体
          • M13mp
          • pUC
          • 在M13基因间隔区插入大肠杆菌的一段调节基因及lacZ的N-端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物即为β-半乳糖苷酶的α片段，突变型大肠杆菌表达w片段（酶的C端）
          • α互补：单独存在的α或w都无β-半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两个片段时，宿主细胞内才有β-半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物
          • 如果外源插入的基因位于lacZ基因内，则会干扰lacZ表达，在含有X-gal的培养基上会出现白色菌落，lacZ基因内无插入，则有lacZ表达，转化菌同样条件下呈蓝色菌落
    • 表达载体
      • 原核表达体系（大肠埃希菌）
        • 能调控转录，产生大量mRNA强启动子，如lac，tac启动子或其他启动子序列
        • 含有适当的翻译控制序列
          • SD序列
          • 翻译起始位点
      • 真核表达体系
        • 含有选择标记、启动子、转录翻译终止信号
        • mRNA加poly(A)信合或染色体整合位点
        • 大多为穿梭载体，有两套复制原点及选择标记，分别在E.coli和真核细胞中起作用
  • 重组DNA的构建和筛选
    • 目的基因的获取——分
      • 化学合成法
      • 基因组DNA文库
        • 分离组织或细胞染色体DNA，利用限制性核酸内切酶（如Sau 3A I或Mbo I）将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带有一种重组DNA分子的多个拷贝，这样生长的全部细菌所携带的所有基因组DNA的集合称为基因组DNA文库
      • cDNA文库
        • 以细胞mRNA为模板，获得双链cDNA片段后，与适当的载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库
      • 聚合酶链反应PCR
    • 载体的选择和构建——选
    • 目的DNA与载体连接——接
      • 黏性末端连接
        • 同一限制酶切位点连接
          • 目的DNA片段和载体两端由同一个限制性内切酶切割生成完全相同的末端
          • 产生结果
            • 载体自连
            • 片段自连
            • 载体与片段相连（正向或反向）
        • 不同限制性核酸内切酶位点连接
          • 由两种不同的限制性核酸内切酶分别切割目的DNA片段和载体的两端，这样可在两端产生不同的黏性末端，从而使目的DNA可以定向插入载体
          • 这种克隆方法称为定向克隆，可有效避免载体自连以及目的DNA片段的反向插入和多拷贝现象
          • 也可以通过一段平末端，一段黏性末端的连接方式实现
        • 用其他方法
          • 人工接头法
            • 平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将含有限制性核酸内切酶位点的人工合成接头或适当分子连到平末端，再用相应的限制性核酸内切酶切除接头远端，产生黏性末端进行连接
          • 同聚物加尾法
            • 利用末端转移酶在目的DNA片段末端加上polyA，在载体对应末端加上polyT，互补的同聚物尾为黏性末端
          • PCR法
            • 针对目的DNA设计一对引物，分别包含了不同的限制性核酸内切酶位点，PCR扩增后可获得带有引物序列的目的DNA，应用对应的限制性核酸内切酶切割产生相应的黏性末端，即可与带有相同的黏性末端的线性化载体有效连接
            • PCR中常用的Taq酶具有在3'末端加上一个A的能力，所以载体末端多一个T即可相互连接，这种连接称为T-A克隆
            • Topo T-A克隆
              • 所用的DNA连接酶为DNA拓扑异构酶
      • 平端连接
        • 目的DNA和载体的两端均为平端
        • 效率较低，需要提高连接酶用量，延长反应时间，降低反应温度、增加DNA片段与载体摩尔比
        • 存在自身环化、双向插入、多拷贝、自连接等缺陷
      • 黏平连接
        • 目的基因与载体之间通过一端黏性连接、一端平端连接
        • 目的基因可以定向插入载体，其效率介于黏性末端连接和平端连接之间
    • 重组DNA导入受体细胞——转
      • 转化
        • 重组DNA直接导入细菌或酵母等宿主细胞的方法，通常是比较小的质粒和黏粒会选用这种方法
        • 实现转化的方法
          • 化学诱导法（氯化钙法）
          • 电穿孔法
      • 转染
        • 重组DNA直接导入真核细胞（酵母除外）的过程
        • 方法
          • 化学方法：磷酸钙共沉淀法、脂质体法
          • 物理方法：显微注射法、电穿孔法
      • 感染
        • 以噬菌体或黏粒载体构建的重组DNA分子，可包装为病毒颗粒，以感染的方式将重组DNA转入受体菌
        • 用逆转录病毒、腺病毒等为载体够贱的重组DNA，可经包装细胞包装成病毒颗粒，以感染的方式将DNA导入真核细胞
    • 重组体的筛选——筛
      • 遗传标志筛选
        • 抗生素标志筛选
        • 标志补救
          • 重组DNA上有基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主细胞的相应缺陷互补，使得宿主细胞能够在相应的选择性培养基中存活进行筛选，这就是标志补救
      • 序列特异性筛选
        • 限制性内切酶酶切法
          • 针对初筛为阳性的克隆，提取重组DNA，用合适的限制性核酸内切酶消化，根据琼脂糖电泳可判断是否有目的DNA片段的插入
          • 根据片段的长短判断插入方向是否正确
        • PCR法：利用序列特异性引物，通过PCR扩增，可鉴定出是否含有目的DNA片段，结合序列分析
        • 核酸杂交法
          • 利用带有标记的DNA探针与转移至硝酸纤维素膜上克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因
      • 亲和筛选
        • 重组DNA进入细胞内能表达其编码产物，可利用抗原-抗体反应或配体-受体反应来筛选
    • 克隆基因的表达
      • 原核表达体系
        • 应具有
          • 适宜的大肠埃希菌选择标志
          • 能调控转录、产生大量mRNA的强启动子
          • 能调控翻译的序列，比如核糖体结合序列以及翻译起始序列
          • 具有合理设计的多接头克隆位点
        • 要求表达产物易于分离、纯化
          • 常用策略：在目的基因前连上一个编码标签肽的序列，表达融合蛋白，使得表达的蛋白多为不溶性包涵体，极易与菌体分离
          • 目的基因与附加序列之间加入适当的裂解位点，可从杂合分子中去除附加序列
          • 考虑其功能，则需要分离后复性或折叠