【医学分子生物学】第13章、DNA损伤和损伤修复

【医学分子生物学（人卫第九版）】第13章思维导图整理 DNA损伤修复(repair of DNA damage)在多种酶的作用下，生物细胞内的DNA分子受到损伤以后恢复结构的现象。 DNA损伤修复的研究有助于了解基因突变的机制，衰老和癌变的原因，还可应用于环境致癌因子的检测。

DNA损伤和损伤修复

• 1.DNA损伤
  • 综述
    • 定义：各种体内外因素所导致的DNA组成与结构的变化成为DNA损伤（DNA damage）
    • 后果（对DNA的结构和功能影响）
      • DNA结构发生永久性改变--突变
      • 失去作为复制和（或）转录的模板功能
    • DNA损伤后受损细胞的转归（取决于DNA损伤的修复效果）
      • 正确修复→DNA结构回复正常→细胞维持正常状态
      • 不能修复→DNA损伤严重不能被有效修复→细胞凋亡、清楚受损细胞
      • 不完全修复→DNA突变、染色体发生畸变→可诱导细胞出现功能改变→衰老、癌变
    • 生物多样性依赖DNA突变与DNA修复之间的平衡
  • 多种因素通过不同机制导致DNA损伤
    • 体内因素
      • DNA复制错误
        • 原因：碱基异构互变，4种dNTP浓度不平衡可引起碱基的错配，绝大多数可纠正，DNA复制的错配率为1/10^10(观察到的)（初次复制的错配率为1/10^8）
        • DNA短重复序列（片段）的缺失或插入（复制打滑），使新生DNA重复序列的拷贝数发生变化导致疾病，亨廷顿病，脆性X综合征，肌强直性营养不良等
      • DNA自身的不稳定性
        • 最频繁因素，DNA受热，pH改变-糖苷键水解，导致碱基的丢失或脱落，脱嘌呤最为普遍
        • 自发脱氨基反应（亚硝酸）
          • C→U
          • A→I（次黄嘌呤）
            • I与C配对
          • G→X（黄嘌呤）
      • 机体代谢过程中产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可直接氧化（oxidation）作用修饰碱基
        • 如修饰鸟嘌呤，产生8-氧鸟嘌呤（8-oxoguanine）等
          • 和A配对
    • 体外因素
      • 物理因素
        • 电离辐射：α粒子、β粒子、X射线、γ射线
          • 使DNA链断裂或发生铰链
          • 激发自由基反应，导致DNA碱基氧化修饰
        • 紫外线：非电离辐射，低波长（260nm，DNA和蛋白质的吸收峰附近）紫外线照射致使胸腺嘧啶二聚体（pyrimidine dimers）形成，也有CT和CC二聚体
      • 化学因素
        • 自由基：羟自由基、氢自由基、活性氧自由基与DNA发生反应，导致碱基、核糖和磷酸基损伤
        • 碱基类似物：5-溴尿嘧啶（5-BU）【抗癌药物】
          • 其他抗癌药物：顺铂、博来霉素、阿霉素
        • 碱基修饰剂、烷化剂导致DNA损伤
          • 亚硝胺（nitrous acid），烷化剂
            • 亚硝胺可以把C→U，和A配对；还可以把A变I，和C配对
            • 烷化剂包括苯并芘、含氮芥子等
        • 嵌入型染料
          • 溴化乙锭、吖啶橙、原黄素
            • 直接插入到DNA碱基对中，引发核苷酸的缺失、移码或插入
      • 生物因素
        • 病毒、霉菌等有诱变作用（黄曲霉素）
  • DNA损伤有多种类型
    • 碱基损伤
      • 定义：化学毒性分子通过对碱基的某些基团进行修饰，改变碱基的理化性质，破坏碱基的结构
      • 案例
        • 亚硝酸等可导致碱基脱氨
        • 在羟自由基的攻击下，嘧啶碱基已发生加成、脱氢等反应，导致碱基环破裂
        • 具有氧化活性的物质可造成DNA中嘌呤或嘧啶碱基的氧化修饰，形成8-氧尿苷或6-甲基尿嘧啶等氧化代谢产物
      • 结果：DNA不稳定，最终导致DNA链的断裂
    • 糖基破坏
      • 定义：DNA分子中的戊糖基的碳原子和羟基上的氢可能与自由基反应，由此戊糖基的正常结构被破坏
      • 结果：DNA不稳定，最终导致DNA链的断裂
    • 碱基错配
      • 碱基类似物的掺入、碱基修饰剂的作用可改变碱基的性质，导致DNA序列中的错误配对
      • 在正常的DNA复制过程中，存在着一定比例的自发的碱基错配发生，最常见的是组成RNA的尿嘧啶替代胸腺嘧啶掺入到DNA分子中
    • DNA链断裂
      • 种类：包括DNA单链断裂和DNA双链断裂
      • 原因
        • DNA链断裂是电离辐射致DNA损伤的主要形式
        • 某些化学毒剂也可导致DNA链断裂
        • 碱基损伤和戊糖基破坏均是引起DNA断裂的原因
        • AP site（apurinic-apyrimidinic site）无嘌呤嘧啶位点（无碱基位点），在内切酶的作用下易造成DNA链的断裂
    • DNA链共价交联
      • DNA链内交联（DNA intrastrand cross-linking）：DNA分子中同一条链中的两个碱基以共价键结合。低波长紫外线照射后形成的嘧啶二聚体就是DNA链内交联的最典型的例子。
      • DNA链间交联（DNA interstrand cross-linking）：DNA分子一条链上的碱基与另一条链上的碱基以共价键结合
      • DNA-蛋白质交联（DNA protein cross-linking）：DNA分子还可与蛋白质以共价键结合
  • DNA损伤的后果——突变（mutation）
    • 突变或诱变对生物可能产生4中后果
      • 致死性
      • 丧失/获取某些功能
      • 改变基因型（genotype）而不改变表现型（phenotye）【同义突变（silent mutation）】
      • 发生了有利于物种生存的结果，使生物进化
    • 点突变类型
      • 转换transition【嘌呤变嘌呤，嘧啶变嘧啶】
      • 颠换transversion【嘌呤变嘧啶，嘧啶变嘌呤】
    • DNA突变类型
      • 插入insertion
      • 删除deletion
      • 合在一起叫indels
    • 两个定义
      • 开放阅读框（open reading frame，OFR）：从起始密码子到终止密码子的DNA序列
      • frame shift：移码突变
    • DNA点突变类型：对氨基酸的改变
      • 同义突变（silent mutation）：位于密码子第三碱基的置换，由于遗传密码的简并，经转录和翻译所对应的氨基酸不变
      • 错义突变（missense mutation）：碱基置换使密码子的意义改变，经转录和翻译所对应的氨基酸改变
      • 无义突变（nonsense mutation）：碱基置换使密码子称为终止密码，导致太链延长提前结束
      • 终止密码突变（terminator codon mutation）：碱基置换使终止密码转变成某种氨基酸密码，指导合成的肽链将延长到出现第二个终止密码才结束
    • 中性突变（neutral mutations）：基因中碱基的突变虽然导致多肽链中相应位置的氨基酸发生变化，但该改变并不引起蛋白质功能的改变。
      • 由于中性突变对生物的生存和繁殖能力没有影响，自然选择对它们就不起作用。它们在种群中的保存、扩散和消失完全是随机的。这种现象称为随机漂变。
    • 染色体
      • inversion mutation
      • 染色体易位chromosome translocation
      • 费城染色体philadelphia chromosome
        • 9号染色体上部分易位到22号上，之后22号叫费城染色体【BCR(原22号上)-ABL(原9号上)能导致白血病】
• 2.DNA损伤修复
  • 直接修复
    • 嘧啶二聚体的直接修复——光复活修复（photoreactivation）
      • 低等生物体内存在一种DNA光裂合酶（DNA photolyase），能够直接识别和结合于DNA链上的嘧啶二聚体部位，使二聚体解聚，完成修复
      • DNA光裂合酶有两个生色基团：次甲四氢叶酸和FADH2（还原性黄素二核苷酸）
      • 哺乳动物缺乏DNA光裂合酶
    • 烷基化碱基的直接修复
    • 单链断裂切口的直接修复
      • DNA连接酶直接修复电离辐射造成的DNA单链上的切口
  • 切除修复（最普遍的DNA损伤修复方式）
    • 碱基切除修复（base excision repair，BER）
      • 过程
        • 识别水解：DNA糖苷酶特异性识别DNA链中已受损的碱基并将其水解去除，产生一个无碱基位点
        • 切除：在此位点的5'-端，无碱基位点核酸内切酶将DNA链的磷酸二酯键切开，同时去除剩余的磷酸核糖部分
        • 合成：DNA聚合酶I在缺口处以另一条链为模板修补合成互补序列
        • 连接：DNA连接酶将切口重新连接，使DNA恢复正常
    • 核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）
      • 注：NER系统并不识别具体的损伤，只是识别损伤对DNA双链螺旋结构造成的扭曲
      • 过程
        • 识别DNA损伤部位
        • 在损伤部位两侧切除DNA片段（excinuclease，核酸内切酶）
        • DNA聚合酶合成一段新的DNA
        • 连接DNA ligase
      • 细菌中
        • UvrA：检测错误
        • UvrB：打开DNA双链
        • UvrC：两个内切酶断点
        • UvrD：取下受损段DNA
        • DNA pol I合成
        • DNA ligase 连接
      • 人类中
        • 两条路：一条与原核相似，一条与转录偶联修复相似
        • 过程
          • 损伤部位识别蛋白XPC和XPA等，再加上DNA复制所需的SSB，结合在损伤DNA的部位
          • XPB和XPD发挥解旋酶的活性，与上述蛋白质共同作用在受损DNA周围形成一个凸起
          • XPG和XPF发生构象改变，分别在凸起的3'-端和5'-端发挥核酸内切酶火行，在增殖细胞核抗原（PCNA）帮助下，切除并释放受损的寡核苷酸
          • 遗留的缺损区由DNA聚合酶δ或ε进行修补合成
          • 由连接酶完成连接
        • XP相关DNA损伤核苷酸切除修复系统缺陷基因
      • 转录偶联修复（transcription-coupled repair，TCR）
        • 核苷酸切除修复不仅能修复整个基因组中的损伤，而且还能够修复正在转录的基因的模板链上的损伤，后者又被称为转录偶联修复
        • 在转录偶联修复中，由RNA聚合酶承担识别损伤部位的任务
  • 碱基错配修复（mismatch repair，MMR）
    • 主要负责纠正
      • 复制与重组中出现的碱基配对错误
      • 因碱基损伤所致的碱基配对错误
      • 剪辑插入
      • 碱基缺失
    • 大肠杆菌MMR
      • 蛋白质：MutH、MutL、MutS、DNA解旋酶、SSB、核酸外切酶 I、DNA聚合酶 III、DNA连接酶
      • 区分子母链：母链高度甲基化（主要是腺嘌呤A），新合成子链中的A的甲基化修饰尚未进行，提示错配修复应在此链上进行
      • 过程：首先由MutS蛋白识别错配碱基，随后由MutL和MutH等蛋白质协同相应的核酸外切酶，将包含错配点在内的一小段DNA水解、切除，经修补、连接后，回复DNA正确的碱基配对
    • 人类MMR
      • MSH2和MSH6复合物可识别包括碱基错配、插入、缺失等DNA损伤，而由MSH2和MSH3形成的蛋白质复合物则主要识别碱基的插入与确实
      • 真核细胞不像原核细胞那样以甲基化来区分母链和子链，可能是依赖修复酶与复制复合体之间的联合作用识别新和成的子链
    • 注意
      • MMR的酶在进化过程中高度保守
  • 重组修复（DNA严重损伤时需要）
    • 同源重组修复（Homologous Recombination repair，HR）
      • 大肠杆菌
        • RecA蛋白：也被称作重组酶
        • 过程
          • 多个RecA单体在DNA上聚集，形成右手螺旋的核蛋白细丝，细丝中具有深的螺旋凹槽，可以死别和容纳DNA链。
          • ATP存在的情况下，RecA可与损伤的DNA单链区结合，使DNA伸展，同时RecA识别一段与受损DNA序列相同的姐妹链，并使之与受损DNA链并列排列，交叉互补，并分别以结构正常的两条DNA链为模板重建损伤链。
          • 最后在其他酶的作用下，解开交叉互补，连接新合成的链，完成同源重组
        • 此过程中，交叉互补的过程形成D-loop；模型称为Holliday junction
      • 酵母
    • 非同源末端连接重组修复（Non-Homologous End Joining recombination repair，NHEJ）
      • 是哺乳动物细胞DNA双链断裂的一种修复方式：两段DNA链的末端不需要同源性就能互相替代连接
      • 同源性不高，修复的DNA序列中可存在一定的差异
      • 关键作用蛋白质：DNA依赖的蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）【一种核内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶】
        • 催化亚基DNA-PKcs：介导DNA-PK的催化功能
        • 能结合DNA游离端的杂二聚体蛋白Ku：与双链DNA的断端连接，促进双链断裂的重接
      • XRCC4和XLF与DNA连接酶IV形成复合物，增强连接酶的活力
  • 跨越损伤修复（translation DNA synthesis，TLS）（差错倾向性DNA损伤修复）
    • 正在复制的DNA聚合酶遭遇尚未修复的DNA损伤（无碱基位点，烷基化碱基，嘧啶二聚体），细胞自动防故障系统能够使复制体绕过损伤部位继续复制，这一机制即跨越损伤修复
    • 重组跨越损伤修复
      • 大肠杆菌：当复制进行到损伤部位时，DNA聚合酶III停止向前移动，脱离受损的DNA模板，在受损DNA部位下游重新启动复制。在新合成的子链DNA上的缺口，通过重组机制修复
    • 合成跨越损伤修复（SOS修复一部分）
      • 大肠杆菌：损伤部位DNA合成由新的DNA聚合酶IV或V（跨越损伤的新的DNA聚合酶虽然依赖模板，但不依赖于碱基互补配对，合成差错率较高）完成
      • 遇错→换酶→瞎配→换回→继续
  • SOS修复反应（E.coli等原核细胞）
    • 由RecA蛋白与LexA蛋白阻遏物相互作用引发的
    • SOS反映有道的产物可参与重组修复、切除修复和错配修复等修复过程
• 3.DNA损伤及其修复的意义
  • DNA损伤具有双重效应
    • DNA损伤时基因突变的基础（DNA损伤的生物学后果）
      • 给DNA带来永久性的改变（突变），可能改变基因的编码序列或基因的调控序列
      • DNA的这些改变使得DNA不能用作复制和转录的模板，使细胞的功能出现障碍，重则死亡
    • 突变是进化的分子基础----生物的多样性
      • DNA突变至基因的多态性——亲子鉴定、个体识别、器官移植、疾病易感性分析
      • DNA突变是遗传性疾病的发病基础
  • DNA损伤修复缺陷与多种疾病相关
    • DNA损伤修复缺陷与肿瘤的发生密切关联
      • MLH1、MSH2突变→错配修复，转录偶联修复→遗传性非息肉性结肠癌、卵巢癌
      • BRCA突变→双链DNA断裂的同源重组修复→遗传性乳腺癌、卵巢癌
    • DNA损伤修复缺陷与遗传性疾病密切关联
      • 着色性干皮病（XP）——相关基因：XPA、XPC、XPD、XPF和XPG编码蛋白参与核苷酸切除修复系统缺陷
      • 共济失调--毛细血管扩张症（AT）【布卢姆综合征】——同源重组，非同源末端结合修复缺陷（ATM基因突变不能修复DNA损伤）
      • 范科尼贫血——重组跨越损伤修复缺陷
      • 奈梅亨断裂综合征（小头症）——同源重组，非同源末端结合修复缺陷
      • 毛发硫营养不良症——核苷酸切除修复缺陷
    • DNA损伤修复缺陷与免疫性疾病密切关联
      • DNA损伤修复缺陷→T淋巴细胞功能缺陷→肿瘤
    • DNA损伤修复能力弱与生命衰老密切关联
      • 人到一定年龄后DNA损伤修复能力逐渐减弱，突变细胞数与染色体畸变率相应增加——早老症，韦尔纳综合征