【医学分子生物学（人卫版）】第12章、DNA合成

【医学分子生物学（人卫版）】第12章、DNA合成的知识框架。DNA合成是指按照预定核苷酸的顺序，将脱氧核苷酸逐个进行人工连接合成DNA链的方法。目前多是采用固相合成法，即是在多聚体支持物上从3′端延伸核苷酸，可自动化操作。

12、DNA合成

• 0.DNA合成
  • DNA(DNA replication)复制
    • 以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。
    • 以亲代DNA为合成模板，碱基配对原则合成子代分子，化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应
    • 酶促修复系统可以矫正复制错误
  • DNA修复(DNA repair)合成
  • 逆转录(reverse transcription)合成DNA
• 1.DNA复制的基本规律
  • DNA复制的主要特征
    • 半保留复制（semi-conservative replication）
    • 双向复制（bidirectional replication）
    • 半不连续复制（semi-discontinuous replication）
    • 高保真性（high fidelity）
  • DNA以半保留方式进行复制
    • 概念
      • 在复制时，亲代DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链
    • 意义
      • 依据半保留复制的方式，子代DNA中保留了亲代的全部遗传信息，亲代与子代DNA之间碱基序列的高度一致。（物种的延续）
      • 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的，自然界还存在着普遍的变异现象。（物种的进化）
  • DNA复制从起始点双向进行
    • 原核生物（prokaryotic）
      • 基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制
    • 真核生物（eukaryotic）
      • 每个染色体有多个起点。呈多起点双向复制特征。每个起点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。
      • 从一个DNA复制起始点开始的DNA复制区域成为复制子（replicon）。复制子是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位。（13-900kb）
  • DNA复制以半不连续方式进行
    • DNA聚合酶（DNA polymerases）只能催化DNA链从5'至3'方向的合成，故子链沿着模板复制时，只能从5'至3'方向延伸。
    • 沿着解链方向生成的子链DNA的合成时连续进行的，这股链称为前导链（leading strand）。
    • 另一条链因为复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能随着模板链的解开，逐段地从5'→3'生成引物并复制子链。这一不连续复制的链称为后随链（lagging strand）。
    • 沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段（Okazaki fragment），真核100-200bp，原核1000-2000bp
    • 复制完成后，这些不连续片段经过去除引物，填补空隙，连接成完整的DNA长链。
  • DNA复制具有高保真性
    • 错配概率为10^(-10)，半保留复制确保亲代和子代DNA分子之间信息传递的绝对保真性
    • 高保真度DNA聚合酶利用严格的碱基配对原则是保证复制保真性的机制之一
    • 体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性
    • DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校读功能以及复制后修复系统（光复活修复、剪切修复、重组修复、SOS）对错配加以纠正
• 2.DNA复制的酶学和拓扑学
  • DNA复制是酶促核苷酸聚合反应
    • 参与DNA复制的物质
      • 底物（substrate）：dNTP（不用dNDP是因为PPi会水解让反应不可逆）
      • 模板（template）：解开成单链的DNA母链，遵循碱基互补规律合成子链5'向3'方向进行
      • 引物（primer）：提供3'-OH末端使dNTP依次聚合
      • 聚合酶（polymerase）：依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol（里面有镁离子）
      • 其他的酶和蛋白质因子：DNA Helicases，Single Strand DNA Binding Protein（SSBP），DNA Ligase，Sliding clamp，Clamp loading
  • DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合
    • 小知识
      • 全程：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymerase）
      • 简称：DNA-pol
      • 活性
        • 5'→3'的DNA聚合活性
        • 核酸外切酶活性
          • 3'→5'外切酶活性：能辨认错配的碱基对，并将其水解
          • 5'→3'外切酶活性：能切除突变的DNA片段（只有DNA聚合酶I有）
    • 原核生物至少有5种DNA聚合酶
      • DNA-pol I
        • 1个亚基
        • 功能
          • 对复制中的错误进行校读
          • 具有5'→3'外切酶和3'→5'外切酶活性
          • 对复制和修复中出现的空隙进行填补（冈崎片段）
        • 木瓜蛋白酶切开
          • 小片段：5'→3'外切酶活性
          • 大片段（Klenow片段）：DNA聚合酶活性+3'→5'外切酶活性
      • DNA-pol II
        • 1个亚基
        • 功能
          • 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复（跨损伤修复TLS）
          • 具有3'→5'外切酶活性
        • 特点
          • 基因发生突变，细菌依然能存活
          • 对模板的特异性不高
      • DNA-pol III
        • 核心酶3个亚基
        • DNA聚合酶III全酶结构
          • pol III core：三个核心酶（α、ε、θ）
            • α亚基：合成DNA
            • ε亚基：3'→5'外切酶活性（复制保真性必须），α亚基可增强其活性
            • θ亚基可能起组装作用
          • β-clamp：三个β-可滑动的DNA夹
            • 两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动
          • clamp loader：一个滑行夹加载器复合物（δ、δ'、ψ、χ、τ）
            • 3个τ亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的3个核心酶能够相对独立运动，分别负责前导链（1个）和后随链（2个）
            • 功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用
        • 复制体（replisome）：DNA聚合酶III全酶、解旋酶（helicase）、引物酶（primase）
      • DNA-pol IV：1个亚基
      • DNA-pol V：2个亚基
    • 常见的真核细胞DNA聚合酶有5种（至少15种）
      • 种类
        • DNA-pol α：起始引发，有引物酶活性
        • DNA-pol β：参与低保真度的复制
        • DNA-pol γ：在线粒体DNA复制中起催化作用
        • DNA-pol δ：合成后随链
        • DNA-pol ε：合成前导链
      • 聚合酶转换（polymerase switching）
        • DNA-pol α合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的DNA-pol δ和DNA-pol ε所替换
    • 真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较
  • DNA聚合酶的碱基选择和校读功能
    • DNA复制的保真性至少要依赖三种机制
      • 遵循严格的碱基配对规律
      • 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能
      • 复制出错时有即时校对功能
    • 复制时的保真性依赖正确的碱基选择
      • 利用“错配”实验发现，DNA pol III对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能
      • DNA pol III对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实现其选择功能
    • 聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正
      • 核酸外切酶（exonuclease）是指能从核酸链末端把核苷酸一次水解出来的酶，外切酶是有方向性的
      • 3'→5'外切酶活性：能辨认错配的碱基对，并将其水解（复制的保真性）
      • 5'→3'外切酶活性：能切除突变的DNA片段（切掉RNA引物、Pol I切口平移）
    • 复制中的DNA分子拓扑学变化
      • 多种酶参与DNA解链和稳定单链状态
        • 解旋酶（helicase）
          • 利用ATP功能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链
        • 引物酶（primase）
          • 复制起始时催化生成RNA引物的酶
        • 单链DNA结合蛋白（SSB）
          • 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整
      • DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase）改变DNA超螺旋状态
        • 拓扑异构酶I：切断一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变味松弛状态。不需要ATP
        • 拓扑异构酶II：切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛；利用ATP功能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态【原核生物拓扑异构酶II也叫促旋酶（gyrase）】
  • DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口
• 5.逆转录
  • 逆转录酶
    • 全称：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase）
    • 三种活性
      • RNA指导的DNA聚合酶活性
      • DNA指导的DNA聚合酶活性
      • RNase H活性
    • Zn离子作为辅助因子
    • 按照5'→3'延长的规律
    • tRNA可用作复制引物
  • RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒（provirus）。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖
  • 在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组（recombination），参与到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合（integration）
• 4.真核生物DNA复制过程
  • 注意
    • 真核生物的基因组复制在细胞分裂周期的DNA合成期（S期）进行
    • 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关
    • 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而事实调控作用
  • 真核生物复制的起始与原核基本相似
    • 真核特点
      • 真核生物复制的起始与原核基本相似：打开双链形成复制叉，形成引发体和合成RNA引物
      • 真核生物每个染色体有上千个复制子，复制起点很多
      • 真核生物复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动。转录活性高的DNA（如centromeres着丝粒）在S期早期合成，卫星DNA，中心体（centrosome）和端粒（telomere）在S期的最后阶段复制
      • 真核生物复制起点较E.coli的oriC复杂，如酵母的ARS
      • 复制的起始需要DNA-pol α（引物酶活性）、pol δ和pol ε参与。还需解旋酶活性、拓扑没和复制因子（replication factor，RF），如RFA，RFC等
      • PCNA（proliferation cell nuclear antigen）在复制起始和延长中发挥关键作用
    • 比较真核生物与原核生物DNA复制的不同
      • 复制起点：原核生物1个，真核生物多个
      • 复制叉移动速度：原核生物快（500bp/s），真核生物慢（50bp/s）
      • RNA引物：原核生物长（十几到几十bp），真核生物短
      • 冈崎片段：原核生物长（1000-2000bp），真核生物短（100-200bp）
      • 连续起始：原核生物可连续复制，真核生物染上色提DNA在每个细胞周期只复制一次
      • 真核生物DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶转换
      • 真核生物切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等
      • 真核生物有核小体组装
      • 真核生物有端粒酶参与染色体末端复制
    • 酵母复制起始点（多个）
      • 酵母复制起点为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）
      • 元件A（富含AT的共有序列）
        • 结合一个特异的蛋白质复合物——复制起点识别复合物（origin recognition complex, ORC）
      • 3个序列（B1、B2和B3）
        • 可以增加复制起点的效率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同
  • 真核生物复制的延长发生DNA聚合酶转换
    • 注意
      • pol α主要催化合成引物（RNA引物12bp+DNA引物25-40bp），然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol δ和pol ε所替换，这一过程称为聚合酶转换
      • DNA pol δ负责合成后随链，DNA pol ε负责合成前导链
      • 核酸酶RNAse H和FEN1负责去除RNA引物
    • DNA聚合酶转换
      • 前导链发生在引发后期，后随链发生在每个冈崎片段合成之际
      • 发生DNA聚合酶转换的原因是Pol α不具备持续合成能力
      • DNA聚合酶转换的关键蛋白使RFC（clamp loader）
  • 真核生物DNA合成后立即组装成核小体
    • 真核生物DNA合成后立即组装成核小体，由新旧组蛋白组成（半旧半新）
    • 复制叉的移动使核小体破坏，但随后迅速形成
  • 端粒酶参与解决染色体末端复制问题
    • 概述
      • 染色体DNA呈线状，复制在末端停止
      • 复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接均在线性DNA的内部完成
      • 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙
    • 端粒（telomeres）
      • 由富含TG的重复序列组成，人的端粒重复序列为5'-(TnGn)-3'
      • 这些重复序列多为双链，但每个染色体的3'端比5'端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题
    • 端粒酶（telomerase）
      • 组成
        • 端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）
        • 端粒酶协同蛋白（human telomerase associated protein，hTP1）
        • 端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTRT）【提供RNA模板和催化逆转录功能】
      • 概述
        • 端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成
        • 端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体3'端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体的3'端。这些新和成的DNA为单链
  • 真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次
    • 概述
      • 真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次
      • 真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活
      • 复制基因（replicator）是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列，复制基因的选择在G1期，组装成前复制复合物（pre-replicative complex，pre-RC），在G1期形成而在S期被激活
    • CDK控制pre-RC的形成和激活
      • 复制许可因子（replication licensing factor）是CDK的底物，为发动DNA复制所必需，在有丝分裂末期进入细胞核，与复制起点结合，等待被刺激进入S期的CDK激活，启动复制。
      • 真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严格控制pre-RC的形成和激活
      • 细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的水平在G1后期升高，激活S期的CDK
    • CDK功能
      • 激活pre-RC，以起始DNA复制
      • 抑制形成新的pre-RC
  • 真核生物线粒体DNA按D环方式复制
    • D环复制（D-loop replication）是线粒体DNA的复制形式
    • 复制起点不在双链DNA的同一位点，内外环复制有时序差别
    • 第一个引物以内环为模板延伸，至第二个复制起点时，又合成第二个反向引物，以外环为模板进行反向延伸
    • DNA pol γ
  • 真核DNA复制叉主要蛋白质的功能
    • RPA（类比SSB）
      • 单链DNA结合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易结合DNA
    • PCNA（类比clamp）
      • 激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性
    • RFC（类比起始蛋白）
      • 有依赖DNA的ATPase活性，结合与引物-模板链，激活DNA聚合酶，促使PCNA结合与引物-模板链
    • Pol α/引发酶
      • 合成RNA-DNA引物
    • pol δ/ε
      • DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复
    • FEN1
      • 核酸酶切除RNA引物
    • RNAseH
      • 核酸酶切除RNA引物
    • Pol I
    • DNA连接酶I
      • 连接冈崎片段
    • DNA解旋酶
      • DNA双螺旋解链，参与组装引发体
    • Tol I和Tol II
      • 拓扑异构酶，去除复制叉前方产生的正超螺旋（使解旋酶容易解旋）
• 3.原核生物DNA复制过程
  • 复制的起始
    • 概述：起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配成起始复合物（replication complex，RC）（噬菌体称为引发体primosome），形成复制叉并合成RNA引物
    • DNA解链
      • 复制有固定起点
        • E.coli上有一个固定的复制起点（replicator），称为OriC，跨度245bp
          • 5组由9个碱基对组成的串联重复序列，形成DnaA结合位点
          • 3组由13个碱基对组成的串联重复序列，富含AT区，易解链
          • 11个被Dam methylase甲基化的GATC位点
        • replicator复制起点：顺式作用的DNA序列
        • initiator protein起始蛋白：识别复制起点的DNA并激活复制起始
      • DNA解链需多种蛋白质参与
        • 由DnaA，DnaB，DnaC共同参与完成
          • DnaA蛋白是一个同源四聚体，可结合OriC的R区（富含AT的地方）
          • DnaB蛋白（解旋酶）在DnaC蛋白的协同下，结合并沿解链方向移动，使双链解开，并逐步置换处DnaA蛋白
        • SSB（single stranded DNA binding protein）结合到DNA单链上，使复制叉保持适当长度，利于核苷酸渗入
        • DnaG（引物酶primase）催化RNA引物生成
        • 拓扑异构酶（异构酶II又称促旋酶）解开超螺旋
        • Hu蛋白和DNA结合使双链DNA弯曲，造成3个13bp正向重复序列被变性，成为开链复合物
      • 解链过程中需要DNA拓扑异构酶
        • DNA拓扑异构酶通过切断、旋转和再连接的作用，实现DNA超螺旋的转型，即把正超螺旋变为负超螺旋
        • 拓扑异构酶I是单链，II是双链（也叫促旋酶）
    • 引物合成和起始复合物形成
      • 起始复合物：含有解旋酶（DnaB）、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构（Hu+DnaA+OriC）【噬菌体称为引发体primosome】
      • 引物酶DnaG
        • 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子，为DNA合成提供3'-OH
        • 引物酶对利福平（RNA聚合酶的抑制剂）不敏感
        • 引物长度约5-10个核苷酸
  • DNA链的延长
    • 概述：复制的延长指在DNA-pol（DNA pol III）催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成
    • 复制叉的长号模型
      • 复制叉上前导链和后随链同时合成，用于协调两条DNA单链复制的模型
  • 复制的终止
    • 注意
      • 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点（ter）处汇合
      • 前导链引物水解后空隙，在环状DNA最后复制的3'-OH端继续延长，即可填补空隙及连接，完成基因组DNA整个复制（不缩短）
    • 过程
      • 切除引物（DNA-pol I）
      • 填补空缺（DNA-pol I）
      • 连接缺口（Ligase）