【医学分子生物学（人卫版）】第14章、RNA的合成

人卫第九版医学分子生物学第14章内容知识导图总结分享。 RNA的合成方法和DNA一样，但和DNA化学合成相比，RNA的化学合成较为困难，原因是碱基之间的偶联效率较低、制品容易分解等，另外RNA合成成本极高，所以RNA合成的价格比DNA的较高。

RNA的合成

• 1、原核生物转录的模板和酶
  • 原核生物转录的模板
    • DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链（template strand），也称作有意义链或Watson链
    • 相对的另一股单链是编码链（coding strand），也称为反义链或Crick 链
  • RNA聚合酶催化RNA合成
    • RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成
      • RNA聚合酶和双链DNA结合时活性最高，但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板
      • RNA聚合酶和DNA的特殊序列——启动子（promoter）结合后，就能启动RNA合成
      • DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长
      • A-U配对
    • RNA聚合酶由多个亚基组成（E.coli）
      • α（2个）：决定哪些基因被转录
      • β（1个）：与转录全过程有关（催化）
      • β'（1个）：结合DNA模板（开链）
      • ω（1个）：β'折叠和稳定性；σ募集
      • 核心酶（core enzyme）
      • σ（1个）：辨认起始点【σ70最常见，E.coli中绝大多数启动子可被其识别】
        • σ32是热激蛋白Hsp，抗生素利福平特异抑制原核生物RNA聚合酶（β亚基）
      • 全酶
  • RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录
    • 概述
      • 转录是不连续、分区段进行的
      • 每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子（operon）
      • 操纵子包括若干个结构基因及其上游（upstream）的调控序列
    • RNA聚合酶保护法（鉴定启动子）
      • DNA与提纯的RNA聚合酶混合温育一段时间
      • 加核酸外切酶进行反应
      • 一小段DNA片段保留，没有被水解（因为RNA聚合酶结合在上面，因而受到保护）
    • 上游-35区是RNA聚合酶对转录起始的识别序列，结合识别序列后，RNA聚合酶向下游移动，到Pribnow盒（-10区）与DNA形成相对稳定的RNA聚合酶-DNA复合物，就可以开始转录
• 2、原核生物的转录过程
  • 转录起始需要RNA聚合酶全酶
    • 1、由RNA聚合酶识别并结合启动子，形成闭合转录复合体（closed transcription complex），DNA仍保持完整的双链结构（在-10区）
    • 2、DNA双链打开，闭合转录复合体成为开放转录复合体（open transcription complex）；开放转录复合体中DNA分子接近-10区域的部分双螺旋解开后转录开始
      • 无论是转录起始还是延长，DNA双链解开的范围只在17bp左右，比复制中的复制叉小很多
    • 3、两个与模板配对的相邻核苷酸在RNA聚合酶催化下生成磷酸二酯键，第一个通常是GTP
      • 第一个与第二个结合后，第一个GTP的三个磷酸一直保留，在转录延长中也是
    • 流产式起始（abortion initiation）
      • RNA聚合酶在完全进入延伸阶段前不从启动子脱离，合成长度小于10个核苷酸的然分子，并将这些短片段RNA从聚合酶上释放而终止转录（延长前重复多次）
      • 被认为是启动子校对（promoter proofreading）的过程，发生可能与RNA聚合酶和启动子的结合强度有关
    • 第一个超过10个核苷酸的RNA成功合成时，进入延长阶段，RNA聚合酶中的σ离开启动子【启动子解脱（promoter escape）/启动子清除（promoter clearance）】
  • RNA聚合酶核心酶独立延长RNA链
    • σ亚基从转录起始复合物上脱离，仅有核心酶留在DNA模板上，并沿DNA链不断前移，催化RNA链的延长
    • RNA链延长过程中的解链和再聚合可视为17bp左右的开链区在DNA上的东台移动，其外观类似泡状，被称为“转录泡”
    • 碱基配对稳定性：CG＞AT＞AU
    • RNA动态校正并不是高保真的
    • 转录延长特点
      • 核心酶负责RNA链延长反应
      • RNA链从5'端向3'端延长，新的核苷酸都是加到3'-OH上
      • 对DNA模板链的阅读方向是3'-端向5'-端，合成的RNA链与之呈反向互补，即酶是沿着模板链的3'向5'方向沿着编码链的5'向3'方向前进的
      • 合成区域存在着动态变化的8bp的RNA-DNA杂合双链（DNA打开17bp）
      • 模板DNA的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解链和再复合的动态变化
  • 原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行
  • 原核生物转录终止分为依赖ρ因子与非依赖ρ因子两大类
    • 依赖ρ因子的转录终止
      • ρ因子
        • 六聚体蛋白质
        • 能结合RNA，对polyC结合力最强，但对poly dC/dG组成的DNA的结合能力低很多
        • 有ATP酶活性和解螺旋酶的活性，使DNA/RNA杂化双链拆离，RNA产物释放
      • 过程
        • 产物RNA3'端产生丰富有规律的C碱基
        • ρ因子识别产物RNA上这些终止信号序列，并与直接和
        • 结合RNA后ρ因子和RNA聚合酶发生构想变化，使RNA聚合酶移动停顿，ρ因子中的解旋酶活性使DNA/RNA杂化双链拆离
        • RNA产物从转录复合物中释放，转录终止
    • 非依赖ρ因子的转录终止
      • （多个U、茎环或发夹）茎环结构使转录终止
        • 使RNA聚合酶变构，转录停顿
        • 局部RNA/DNA杂化短链的碱基配对是最不稳定的
        • RNA链上的多聚U也是促使RNA链从模板上脱落的重要因素
• 3、真核生物RNA的合成
  • 真核生物至少有三种DNA依赖的RNA聚合酶
    • 种类
      • I
        • 转录产物：45S rRNA
        • 对鹅膏蕈碱耐受
        • 定位：核仁
        • 催化合成rRNA前体
      • II
        • 转录产物：前体mRNA、lncRNA、piRNA、miRNA
        • 对鹅膏蕈碱极敏感（一加就失活）
        • 定位：核内
        • 催化合成lncRNA、miRNA、piRNA
      • III
        • 转录产物：tRNA、5S rRNA、snRNA
        • 对鹅膏蕈碱中度敏感
        • 定位：核内
        • 催化合成tRNA、5S rRNA和snRNA
    • 组成
      • RNA聚合酶II由12个亚基组成，最大的亚基称为RPB1
      • RPB1的羧基末端有一段共有序列，称为羧基末端结构域（carboxyl-terminal domain, CTD）
        • I和III中没有CTD
        • CTD的磷酸化在转录起始中起关键作用
      • RNA pol II是真核生物中最活跃、最重要的酶
    • 三种聚合酶与启动子的结合
      • pol I
        • UBF结合core sequence和UCE（the upstream control element）、SL1（蛋白selectivity factor1）
      • pol II
        • 需要TFIID，类似原核生物中的σ因子
      • pol III
        • tRNA promoter
          • TFIIIB、TFIIIC、TBP
        • 5S rRNA
          • TFIIIB、TFIIIC、TFIIIA、TBP
    • 双向启动子
      • 是位于相邻且转录相反的基因之间的一段DNA，两个转录起始点的距离小于1kb
      • 双向转录基因对
        • 人基因组中11%是双向转录基因对
        • 头对头：相邻且转录方向相反错开
        • 尾对尾：相邻且转录方向相对
        • 头对尾：相邻且方向相同
    • 其他RNA聚合酶
      • RNA聚合酶IV
        • 在植物中合成siRNA（小干扰RNA）
      • RNA聚合酶V
        • 在植物中合成的RNA与siRNA介导的异染色质形成有关
      • 真核细胞线粒体的RNA聚合酶
        • 单亚基RNA聚合酶蛋白质家族
        • 在功能和性质上与原核细胞RNA聚合酶类似
        • 活性可被利福平或利福霉素抑制
  • 顺式作用元件和转录因子在真核生物转录起始中具有重要作用
    • 与转录起始有关的顺式作用元件（cis-acting element）
      • 近端调控元件
        • 核心启动子序列如：TATA box（不像原核固定位置，管家基因无TATA box），Hognest box
          • 核心启动子区是转录起始前复合物PIC的结合位点
        • 启动子上游元件（近端启动子元件）
      • 远隔序列
        • 增强子
      • 起始子（Initiator，Inr）
    • 转录因子（transcriptional factors，TF）或反式作用因子（trans-acting factors）
      • 真核生物中不同的RNA聚合酶需要不同的TF配合完成转录的起始和延长
      • 种类
        • 通用转录因子（general transcription factor）或基本转录因子（basal transcription factor）：直接或间接结合RNA聚合酶的一类转录调控因子
          • 注意
            • TF I/II/III 分别对应RNA pol I/II/III
            • TF II分为TF II A/B等
            • 通用转录因子在真核生物进化中高度保守
          • 种类
            • TF II D
              • 由TATA盒结合蛋白（TBP）、8~10个TBP相关因子（TAF）组成
              • TBP覆盖TATA盒
              • TAFs（辅激活因子，co-activator）对诱导引起的增强转录是必要的
            • 中介子（mediator）
              • 反式作用因子和RNA聚合酶之间的蛋白质复合体，
              • 促进TF II H对RNA聚合酶羧基端结构域的磷酸化
              • 属于辅激活因子
            • 上游因子（upstream factor）
              • 与启动子上游元件如GC盒，C/EBP结合到CAAT盒上
              • 调节通用转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶在启动子的定位及起始复合物的形成，从而协助调节基因的转录效率
        • 特异转录因子
          • 特定类型的细胞中高表达，并对一些基因的转录进行实践和空间特异性调控的转录因子
          • 主要与远隔调控序列如增强子等结合的转录因子
          • 例：可诱导因子（inducible factor）与增强子结合
    • 转录起始前复合物（preinitiation complex，PIC）
      • RNA聚合酶不直接识别和结合模板的起始区，而是依靠转录因子识别并结合起始序列
      • 闭合转录复合体的形成步骤
        • TF II D中的TBP识别TATA盒，在TAFs（TF II D上）的协助下结合到启动子区，然后TF II B与TBP结合，同时TF II B也能与DNA结合，TF II A（不必需）可以稳定与DNA结合的TF II B- TBP复合体
        • TF II B-TBP复合体与RNA pol II-TFIIF复合体结合，降低RNA pol II与DNA的非特异部位的结合，协助RNA pol II靶向结合启动子
        • TF II E和 TF II H加入，形成闭合复合体，装配完成，形成转录起始前复合物PIC
      • TF II H功能
        • 解旋酶活性：使转录起点附近的DNA双螺旋解开，使闭合转录复合体称为开放转录复合体，启动转录
        • 激酶活性：使RNA pol II的CTD磷酸化
        • CTD磷酸化能使开放复合体构象发生改变，启动转录。（TF II 的D/A/B等脱落）
        • 合成一段核苷酸后，TF II 的E/H释放，进入转录延长期（TF II F依然结合RNA聚合酶II，防止其余DNA的结合）
    • 少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录
      • 为保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子
      • 少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录：它们（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因
      • 可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、RNA聚合酶结合，但有时也可直接与基本转录因子、RNA聚合酶结合
      • 2000种编码DNA结合的蛋白基因，多为反式作用因子
  • 真核生物转录延长过程不与翻译同步
    • 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因为有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象
    • RNA聚合酶前移处处都遇上核小体（nucleosome）
    • 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象
    • 核小体在转录过程中可能发生一时性解聚并重新装配
  • 真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行
    • 特点
      • 真核生物的转录终止和转录后修饰密切相关
      • 真核生物mRNA有poly A尾巴结构，是转录后才加进去的
      • 转录不是在poly A的位置上终止，而是超出数百个乃至上千个核苷酸后才停顿。已发现，在读码框架的下游，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列。这些序列称为转录终止的修饰点
    • 模型
      • 鱼类（Torpedo）模型
      • 空间异构（Allosteric）模型
• 4、真核生物前体RNA的加工和降解
  • 真核前体mRNA经首、尾修饰、剪接和编辑加工后才能成熟
    • 前体RNA（precursor RNA，pre-RNA）
      • 又叫初级RNA转录物（primary RNA transcript）或核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）
    • 前体mRNA在5'末端加入“帽”结构
      • 帽结构是7-甲基鸟嘌呤
      • 形成过程
        • 加帽酶（capping enzyme）
          • 磷酸酶去除γ磷
          • 鸟嘌呤核苷基转移酶消耗GTP生成5'-5'三磷酸键
        • 甲基转移酶【S-腺苷甲硫氨酸提供甲基】
          • N-7-甲基转移酶：G7位上的甲基
          • 2'-O-核糖甲基转移酶：G后第一个或第二个C2'位上的甲基
      • 功能
        • 使mRNA免遭核酸酶的攻击
        • 与帽结合蛋白复合体（cap-binding complex of protein）结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成
    • 前体mRNA在3'端特异位点断裂并加上多聚核苷酸尾（除了组蛋白）
      • 尾部修饰是和转录终止同时进行的过程
      • poly（A）的长度与mRNA的寿命呈正相关
      • 组蛋白没有poly（A）
      • poly（A）尾的出现是不依赖于DNA模板的
      • 前体mRNA分子的断裂和加多聚腺苷酸尾是多步骤过程
      • 过程
        • 断裂和聚腺苷酸化特异性因子（CPSF）先与AAUAAA序列形成不稳定的复合体
        • 三种蛋白质【断裂机动因子（CStF），断裂因子I（CF I），断裂因子II（CF II）】与CPSF-RNA复合体结合（CStF与断裂点的下游富含GU序列相互作用使形成的多蛋白复合体稳定）
        • 前体mRNA分子断裂前，多聚腺苷酸聚合酶（PAP）加入蛋白质复合体，在断裂后，立即进行多聚腺苷酸化（前12个慢，而后快速）
        • （快速期）多聚腺苷酸结合蛋白II（PABP II）可提高多聚腺苷酸聚合酶（PAP）合成多聚腺苷酸的速度；当尾结构足够长时，PABP II使PAP停止作用
    • 前体mRNA的剪接主要是去除内含子
      • 细胞核内出现的初级转录物的分子量往往比胞质内出现的成熟mRNA大几倍，甚至数十倍
      • 实验：鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交
      • 过程
        • 内含子形成套索RNA（lariat RNA）被剪除
        • 内含子在剪接接口处剪除
          • 第一个内含子一般比较大
          • 内含子两端有一定的保守性【5'-GU……AG-3'被称为剪接接口或边界序列】
        • 剪接过程需要两次转酯反应
          • 需要剪接体参与
          • 过程
            • 腺苷酸A上羟基攻击第一个内含子核苷酸
            • 上一个外显子上最后一个核苷酸上的羟基攻击内含子最后一个核苷酸
        • 剪接体是内含子剪接场所
          • 前体mRNA的剪接发生在剪接体（spliceosome）
          • 剪接体形成步骤
            • 内含子5'-端和分支点分别与U1、U2的snRNA结合，使snRNA结合在内含子上
            • U4、U5、U6加入，形成完整的剪接体
            • 结构调整：释放U1和U4，U2和U6形成催化中心，发生第一次转酯反应形成套索，随后发生第二次转酯反应
          • snRNA是以snRNP的形式参与剪接体的组装的，但剪接体中起催化作用的是其中所含的RNA组分
      • 前体mRNA分子有剪切和剪接两种模式
        • 剪切指剪去某些内含子后，上游的外显子3'端再进行多聚腺苷酸化，不进行相邻外显子之间的连接反应
      • 前体mRNA可以发生可变剪接（选择性剪接）
    • mRNA编辑是对基因的编码序列进行转录后加工
      • RNA编辑
        • 定义
          • 有些基因的蛋白质产物的氨基酸序列与基因的初级转录物序列并不完全对应，mRNA上的一些序列在转录后发生了改变
        • 种类
          • Guide RNAs直接插入或删除U
          • 脱氨基作用
            • C变成了U
            • A变成了I
      • 分化加工（differential RNA processing）
        • RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的
  • 真核前体rRNA经过剪切形成不同类别的rRNA
    • 真核细胞的rRNA基因（rDNA）属于冗余基因（redundant gene）族的DNA序列，即染色体上一些相似或完全一样的纵列串联基因单位的重复【还有5S rRNA，组蛋白基因，免疫球蛋白基因等】
    • 45S rRNA经核糖核酸内/外切酶的剪切，去除内含子，而产生成熟的18S，5.8S，28S的rRNA
    • rRNa成熟后，就在核仁上装配，与核糖体蛋白质一起形成核糖体，输送到胞质
  • 真核前体tRNA的加工包括核苷酸的碱基修饰
    • 过程【以酵母前体tRNA（Tyr）为例】
      • 核糖核酸酶P切除5'端16个核苷酸前导序列
      • RNase Z核糖核酸酶切除氨基酸臂的3'端2个U【有时RNase D也参与切除过程】，然后氨基酸臂的3'端再由核苷酸转移酶加上特有的CCA末端
      • 茎环结构中一些核苷酸碱基经修饰为稀有碱基
        • 甲基化：嘌呤甲基化成甲基嘌呤
        • 还原反应：尿嘧啶还原成二氢尿嘧啶（DHU）
        • 核苷内的转位反应：尿嘧啶核苷转变成假尿嘧啶核苷（φ）
        • 脱氨反应：某些腺苷酸脱氨成为次黄嘌呤核苷酸（I）
      • tRNA剪接内切酶TSEN（蛋白酶）：剪切茎环结构中部14个核苷酸的内含子
  • RNA催化一些内含子的自剪接
    • 由RNA分子催化自身内含子剪接的反应称为自剪接（self-splicing），属于核酶
    • 四种类型的内含子
      • 核酶催化（rRNA）
        • 组I型内含子：以游离的鸟嘌呤核苷或鸟嘌呤核苷酸作为辅因子完成剪接【四膜虫rRNA前体、噬菌体mRNA前体、细菌tRNA前体】
        • 组II型内含子：在体外能够自我简介，不需要任何蛋白质酶的催化；体内需要蛋白质帮助折叠成二级结构。通过产生一个套索状中间体来进行自剪接【线粒体和叶绿体的mRNA前体和tRNA前体】
      • 剪接体催化（mRNA）
      • 蛋白质酶催化（tRNA）
  • 真核RNA在细胞内的降解有多种途径
    • 依赖于脱腺苷酸化的mRNA降解是重要的正常mRNA代谢途径
      • 过程1
        • 脱腺苷酸化反应
        • 脱帽
        • mRNA被5'-3'核酸外切酶识别并水解
      • 过程2
        • 脱腺苷酸化反应
        • mRNA被3'-5'核酸外切酶识别并水解
      • 非依赖于脱腺苷酸化的mRNA降解
        • 脱帽
        • mRNA被5'-3'核酸外切酶识别并水解
      • 核糖核酸内切酶参与的mRNA降解（中间切，向两边降解）
        • 核酸内切酶
        • mRNA被5'-3'核酸外切酶和3'-5'核酸外切酶水解
      • microRNA诱导的mRNA降解
    • 无义介导的mRNA降解（NMD）是一种重要的真核生物细胞mRNA质量监控机制
      • 真核细胞mRNA的异常剪接可能会产生无义的终止密码子，称作提前终止密码子（PTC），也可由错误转录或翻译过程中的移码而产生
      • 由PTC介导的mRNA降解称为无义介导的mRNA降解（NMD），是广泛存在的mRNA质量监控的重要机制
      • 外显子拼接复合体（EJC）是诱导NMD的重要因子