基因工程概述（逐渐更新）

基因工程（Genetic Engineering），又称基因拼接技术和DNA重组技术，是一门以分子遗传学为理论基础，通过分子生物学和微生物学的现代方法，对生物的基因进行改造和重新组合的科学技术。正在慢慢更新（因为才讲到第六章）

基因工程

• 第二章基因突变及其机制
  • 第一节
    • 突变类型与基因符号
      • 基因突变
        • 突变名词
          • 突变
            • 遗传物质核酸中的核苷酸序列发生了稳定的可遗传的变化。
          • 突变体
            • 带有突变基因的细胞或个体
          • 突变型
            • 突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对 的原存在状态称为野生型
        • 突变意义与应用
          • 突变是进化的基础
          • 为遗传学提供材料
          • 工业微生物育种重要手段
      • 突变类型
        • 自发突变
          • 未人工处理而发生的突变
        • 诱发突变
          • 利用物理和化学手段对生物体处理
      • 突变类型
        • 染色体水平突变
          • 染色体数目变化
            • 整倍体
            • 非整倍体
            • 部分二倍体
          • 染色体结构变化
            • 缺失
              • 染色体片段缺失
            • 重复
              • 染色体片段再出现
            • 倒位
              • 染色体片段在原位发生180°颠倒
            • 易位
              • 染色体片段连接到另一非同源染色体上
        • 基因水平突变
          • 碱基置换
            • 转换和颠倒
          • 移码突变
            • 1. 移码突变：基因中碱基对的顺序发生改变，导致基因编码序列发生偏移，可能影响蛋白质结构和功能。
            • 2. 原因：外源DNA插入、缺失或替换等不正常重组事件导致；也可能是内源性DNA修复机制失误所致。
            • 3. 类型：包括碱基对插入、缺失、替换、倒位和重复等多种形式。
            • 4. 影响：可能导致基因表达产物异常、细胞功能受损甚至死亡；也可能增加肿瘤发生风险等。
            • 5. 检测方法：常用PCR扩增、测序等技术进行检测；还可以通过生物化学和分子生物学手段进行鉴定。
        • 遗传编码特性的改变
          • 改变遗传编码特性
            • 错义突变
              • 错义突变是指基因中一个碱基对的改变导致氨基酸序列发生变化，从而产生新的编码蛋白质
                • 1. 随着基因编辑技术的发展，错义突变研究将更加深入和广泛。
                • 2. 错义突变通常由自然突变或实验室操作引起，如基因编辑技术。
                • 3. 错义突变可能影响蛋白质功能，导致生物体出现疾病或适应性特征的变化。
                • 4. 错义突变的检测方法包括DNA测序、核苷酸测序和荧光定量PCR等。
                • 5. 错义突变在基因工程中可能导致目的基因表达异常，需要进行优化和调整。
                • 6. 错义突变的研究有助于深入了解基因功能和遗传规律，为疾病治疗提供理论依据。
                • 7. 错义突变在生物多样性保护和生物资源利用方面具有重要价值。
                • 8. 错义突变可能引发新的遗传病，需要加强相关疾病的预防和控制。
            • 无义突变
              • 1. 无义突变：基因中出现无效的DNA序列，导致蛋白质功能丧失或异常。
              • 2. 突变类型：无义突变是基因突变的一种，主要影响遗传编码特性。
              • 3. 遗传编码特性改变：无义突变导致基因编码的蛋白质结构和功能发生改变，可能产生新的表型特征。
              • 4. 机制：无义突变通常由碱基对的替换、插入或缺失引起，造成基因片段的错位或破坏。
              • 5. 影响范围：无义突变可能影响整个基因或特定基因区域，进而影响相关蛋白质的功能。
              • 6. 检测方法：通过测序技术检测基因序列，分析其变异情况，以确定是否存在无义突变。
            • 移码突变
          • 不改变遗传编码特性
            • 同义突变
              • 1. 同义突变：基因序列中相同位置的变异现象，不改变遗传编码特性。
              • 2. 突变类型：同义突变是基因突变的一种，不影响基因功能和表达。
              • 3. 遗传编码特性：同义突变不改变基因的遗传信息，仍能传递给后代。
              • 4. 机制：同义突变可能是DNA修复过程中的错误匹配或插入/删除事件。
              • 5. 《基因工程》第二章：同义突变是基因工程研究的重要内容，有助于提高作物抗病、抗逆性等性状。
            • 中性替换
              • 1. 中性替换是一种常见的基因突变类型，发生在DNA中的任意位置。
              • 2. 这种突变不改变遗传编码特性，但可能导致蛋白质功能发生改变。
              • 3. 中性替换可能由多种因素引起，如环境因素、病毒感染等。
              • 4. 研究中性替换有助于我们理解基因突变的机制和影响。
        • 按突变表型变化
          • 形态突变型
            • 引起个体和菌落形态发生改变
          • 生化突变型
            • 引起特定生化功能丧失而无明显形态学变化
          • 营养缺陷型
            • 1. 基因突变可能导致营养缺陷型，例如某些氨基酸的替换导致蛋白质功能异常，进而影响机体对营养物质的吸收和利用。
            • 2. 突变类型中的点突变可能使酶活性降低或完全丧失，从而影响细胞代谢过程，导致营养不良。
            • 3. 基因工程中，意外引入的外源基因可能与宿主基因发生相互作用，导致遗传密码的改变，进而影响蛋白质功能，引发营养缺陷型疾病。
          • 抗性突变型
            • 抗性突变型：指基因工程中，受基因突变影响而产生的对某些物质具有抗性的生物类型。
          • 致死突变型
            • 基因突变导致个体死亡
          • 条件致死突变型
            • 在某一条件下具有致死效应
          • 调节突变型
            • 丧失对某一基因和操纵子表达能力调节
          • 产量突变型
            • 产生代谢产物明显与正常型有差别
      • 基因符号
        • 基因命名原则
  • 第二节
    • 基因突变规律
      • 自发性
        • 突变可以自发产生，微生物突变与其所处环境因素没有对应关系
      • 随机性
        • 基因突变发生的时间、个体、位点和所产生的表型变化等方面都是随机的
        • 突变热点
          • DNA分子上突变频率大的位点
      • 稀有性
        • 突变以一定频率发生在个别细胞中
      • 独立性
        • 一个基因的突变不受其他基因影响
        • 增变基因
          • 其基因突变会导致整个基因组的突变频率明显上升
        • 交叉抗性
      • 可诱变性
        • 可通过某些理化因素处理，而大幅提高基因频率
      • 可逆性
        • 突变型可回复突变为野生型
      • 可遗传性
        • 突变基因可通过复制传递给子代基因
  • 第三节
    • 自发突变的机制
      • 环境因素的作用
        • 如辐射、环境污染物、热等
      • 自身代谢产物的作用
        • 具有化学诱变的作用
        • 亚硝酸、过氧化物等等
      • 转座因子的作用
        • 能将自身插入基因组新位置的DNA序列
        • 转座
          • 转作因子通过非同源重组方式，从染色体某一部位转移到另一部位或其他染色体的现象
        • 转座生物学效应
          • 导致插入突变
          • 干扰宿主基因与调控原件之间关系，改变DNA结构而影响基因表达
          • 基因组获得新基因形状
          • 造成染色体畸变；重复、倒位、缺失
      • DNA分子运动
        • DNA复制过程中发生碱基配对的错误，而引起自发突变
          • 频率很低
        • 环出效应
          • 复制过程中会形成一个DNA母链环，可能缺失或滑移错配
      • DNA自发化学变化与复制差错
        • 化学变化
          • 自发氧化脱氨
            • 胞嘧啶自发氧化脱氨变成尿嘧啶
          • 5mC自发脱氨转变为胸腺嘧啶
        • 复制差错
          • 保证精确性
            • DNA聚合酶对底物的选择性
            • 复制错误修复系统
            • N-糖激酶修复系统
              • 1. N糖激酶修复系统是一种基因调控机制，用于纠正DNA复制过程中的错误。
              • 2. 该系统通过识别并修复DNA中的碱基对错配，确保基因信息的准确传递。
              • 3. N-糖激酶主要参与核苷酸的修复，包括腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的修复。
  • 第四节
    • 诱变剂及其作用机制
      • 诱变
        • 人为利用物理或化学因素处理微生物引起突变
      • 诱变剂
        • 能诱发生物基因突变，且突变频率远高于自发突变率的物理因子或化学性质
      • 诱变剂种类
        • 化学诱变剂
          • 一类能对DNA起作用改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质
          • 类型
            • 碱基类似物
              • 其分子结构同DNA分子中碱基类似，则可以取代碱基进入DNA
              • 注意事项
                • 只对生长态微生物细胞起作用
            • 烷化剂
              • 最常用一类化学诱变剂
              • 具有一个或多个活性烷基
              • 鸟嘌呤N7是最容易引起反应位点
                • 作用
                  • 烷化嘌呤引起碱基配对错误
                    • 成为季胺集团后，尿嘌呤更加容易发生烯醇式互变异构，从而引起碱基配对错误
                  • 造成脱嘌呤的作用
                    • N7成为成为季胺集团后，减弱N9位上的N-糖苷键，引起脱氧核糖-碱基键发生水解，进而脱落
                  • 鸟嘌呤交联
                    • 鸟嘌呤通过N7位点供价结合，发生交联
              • 注意事项
                • 烷化剂有很高活性，且能与水发生反应，所以溶液必须使用前现配，并且注意PH值
            • 移码突变剂
              • 一类能嵌入到DNA分子中的化学诱变剂
              • 注意事项
                • 其作用于生长态细胞，需经过DNA复制才能形成突变
        • 物理诱变剂
          • 紫外线UV
            • 有效波长 265nm
            • 作用机理
              • 胸腺嘧啶二聚体
              • 嘧啶水合物
              • 交联
              • DNA断裂
            • 效应
              • 移码突变
              • 碱基置换
              • 细胞死亡
            • 在红光下操作，避免光复活
          • 电离辐射
            • X射线波长0.06~136nm
            • γ射线波长为0.006~1.4nm
            • 范围
            • 机理
              • 直接作用；打断化学键
              • 间接作用；通过自由基打断化学键，引起缺失与损伤
              • 使染色体畸变，碱基置换，移码突变
          • 离子注入
            • 离子注入的质量、电荷、能量参数可按需要进行不同组合。可使诱变具有较高方向性与可控性产生生物化学效应比单一辐射更丰富
            • 生物效应
              • 物理阶段
                • 入射粒子同靶原子发生碰撞，导致原子激发、电离，能量损失，同时慢化的原初入射离子沉积
              • 化学阶段
                • 能量传递、原子接力和入射离子沉积会导致DNA分子断裂、重排，引起基因突变和染色体畸变
              • 生物阶段
                • 若分子损伤不能得到修复，则会表现出细胞死亡或基因突变
          • 快中子
            • 从回旋加速器、静电加速器、或原子反应堆中产生
            • 能量最高，为0.2~10MeV
          • 空间诱变
            • 利用卫星或高空气球搭载微生物，经特殊空间环境条件作用，引起生物体遗传变异
            • 特点
              • 突变频率高、突变谱广、变异幅度大、变异性状稳定快、可获得有益突变
            • 诱变机理
              • 微重力
                • 诱发突变；抑制DNA断链修复；提高微生物对诱变剂的敏感性
              • 空间辐射
                • 宇宙射线；太阳粒子
              • 转座子激活
                • 太空环境使转座子激活，活化转座子通过位移、插入与丢失，进而导致基因的变异与染色体畸变
  • 第五节
    • 突变生成过程
      • 诱变剂接触DNA分子之前
        • 细胞透性影响诱变剂诱变效应
        • 前诱变剂在细胞质作用下传化为诱变剂，诱变剂则可能与细胞质物质反应失去诱变活性
      • DNA损伤
        • 前突变；诱变剂造成DNA分子某一位置损伤
        • DNA分子损伤的类型
        • 不同诱变剂造成损伤不同
      • DNA损伤修复
        • DNA分子要求保持高度精确性与完整性
        • DNA分子损伤修复系统
          • 光修复机制
            • 光复活
              • 细菌在紫外线照射后利用可见光照射，可显著增加细菌存活率，降低突变率
            • 机制
              • 光复活酶催化嘧啶二聚体分解为单体，损伤DNA分子恢复正常
            • 只作用于紫外线照射形成的损伤
            • 光复活示意图
          • 切除修复
            • 为细胞主要修复系统，DNA复制前进行
            • 参与的酶
              • 限制性内切酶
              • 核酸外切酶
              • DNA聚合酶
              • DNA连接酶
            • 修复过程
              • 切→补→切→封
            • 使损伤DNA分子恢复正常
          • 重组修复
            • 一种越过损伤而进行的修复
            • 不将损伤基因除去，而是复制后经过染色体交换，使智联上的空隙不再正对T=T，而是面对正常单链
            • 留在模板上的二聚体：写除修复加以除去，或经细胞分裂而稀释
            • 复制后重组修复机制
          • SOS修复系统
            • 是一种跨越损伤修复机制而进行的修复
            • 该系统为单链DNA所激活
            • 跨越损伤复制所涉及聚合酶保证度差且无校读功能
            • 损伤部位不会被切除，以其模板合成子链会有大量配对错误碱基
            • 是一种倾向差错修复机制
      • 突变基因的形成
        • 前突变的不同命运
          • 损伤太大，细胞死亡
          • 损伤较小，细胞存活
            • DNA损伤
              • 未修复，DNA经复制变为突变型
              • 被修复，DNA恢复正常，不发生突变
              • 进行倾向差错修复，发生突变
        • 环境因素影响
          • 条件环境影响DNA修复系统酶活性
            • 咖啡碱抑制切除修复系统酶活性
            • 光复活系统需要可见光激活
            • SOS修复依赖蛋白质合成，因此丰富的培养基可强化诱变作用
          • 有些物质可增强或减弱诱变剂活性
            • 助变剂
              • 本身没有诱变作用，但可以增强诱变剂的诱变作用
            • 抗变剂
              • 能减弱诱变剂效应
      • 从突变到突变表型
        • 表型延迟
          • 突变体表型改变落后于其基因型改变
          • 可通过诱变后培养消除
        • 分离性延迟
          • 突变基因由杂合状态到纯合状态所造成的表型延迟
        • 生理性延迟
          • 由于基因产物的稀释过程所造成的表型延迟
• 第三章基因操作的载体
  • 载体
    • 载体功能
      • 运送外源基因高效转入受体细胞
      • 为外源基因提供复制或整合nengli
      • 为外源基因的扩增和表达提供必要条件
    • 载体特性
      • 能在寄主细胞中进行独立复制与表达
      • 具有1-2个选择标记基因，如对抗生素抗性基因等
      • 具备多克隆位点（MCS）
      • 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
      • 自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数搞，易于操作与DNA的制备，而且可携带外源DNA的片段的长度范围较宽
    • 载体类型
      • 克隆载体
        • 以增值DNA片段作为目的的载体
        • 特性
          • 具有独立复制起始点
          • 具有较小的相对分子量
          • 具有较高拷贝数
          • 具有便于选择的标记
          • 易于导入细胞
          • 具有安全性
      • 表达载体
        • 胞内表达载体
        • 分泌表达载体
        • 用来将克隆到的外源基因在宿主细胞内表达成蛋白质的载体
        • 按特殊设计构建，能正常转录并翻译成蛋白质的载体
        • 包括
          • 启动子
          • 操纵位点序列
          • 多克隆位点
          • 转录及翻译新号
          • 质粒载体的赋值起始点
          • 抗性标记基因等
      • 整合载体
        • 把一个基因插入到染色体组中
  • 质粒载体
    • 关于
      • 质粒是广泛存在于染色体外，能自主复制稳定遗传，裸露的环状双链DNA分子
      • 质粒大小差异很大，1kb~~~200kb
      • 质粒可以在寄主细胞中友好借住
      • 复制类型
        • 严紧类，可拷贝1-3
        • 松弛类，可拷贝10-60
      • 质粒不亲和性
        • 两种亲缘关系密的不同质粒，不能再同一宿主细胞中稳定共存
      • 存在形式
        • 超螺旋
        • 开环双螺旋
        • 线状双螺旋
    • 质粒
      • 作为基因工程载体具备
        • 复制起始区Ori
        • 选择标记基因区AMP
          • 在基因工程中的一类用于选择转化细胞的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因
        • 多克隆位点LacZ
          • 克隆载体中用于插入外源DNA片段的特定区域，存在多个紧密相连的限制性内切酶位点组成
        • 等
      • 质粒DNA的分离与纯化（碱变性法）
        • 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段间拓扑学差异而分离
        • PH12.0-12.5时，线性DNA会变性，而共价闭合环状质粒DNA不会变性
        • 通过冷却或恢复中性PH使其复性，cccDNA可准确快速复性
  • 噬菌体载体
    • 噬菌体
      • 可高效高特异性地侵染宿主细胞，再进行自主复制繁殖，或整合入宿主基因组潜伏，在一定条件下会相互转化
      • λ噬菌体
        • 生物学结构
          • 温和型噬菌体
          • 由包装蛋白与DNA组成
          • 全长48502个核苷酸
          • 至少有61个基因
          • 结构图
          • DNA
        • λDNA载体构建
          • 缩短长度
          • 加装选择标记
        • 作为载体优点
          • 可高效转染大肠杆菌
          • 装载能力大为25kb，远大于质粒装载量
          • 重组λ-DNA分子的筛选与提取较为方便
          • λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因
      • M13噬菌体
        • 生物学特征
          • 外形呈丝状
          • 有外壳包装蛋白和正链DNA组成
          • 不裂解宿主细胞，但抑制生长
          • 6407个核苷酸
          • 至少有10个基因
          • 结构图
        • 作为载体的特点
          • 使克隆DNA片段以特定单链形式输出受体细胞外。在DNA定向突变中更有用
          • M13重组分子筛选简便
          • 装载量小只有1.5kb
  • 柯斯质粒载体
    • 结构
      • 多克隆位点区
      • 含有cos位点的λDNA区
      • 复制起始位点和抗性标记区
      • 结构
    • 特点
      • 具有λ噬菌体的特性
      • 具有质粒载体的特性
      • 高容量的克隆能力
  • 人工染色体载体
• 第四章基因工程的操作过程
  • DNA的体外重组（切与接）
    • 同种内切酶产生的黏性末端连接
    • 同尾酶产生的黏性末端的连接
    • 不同黏性末端的连接
    • 人工粘性末端的连接
      • 平末端DNA的末端加尾
      • 3’突出末端
    • 黏性末端的更换
    • 重组率
      • 定义
        • 重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数
        • 一般为25-75%
        • 时衡量连接反应效率的重要指标，较高重组率可提高后续效率
      • 提高重组率方法
        • A、提高外源DNA片段与载体分子比
          • 5：1---10:1
        • B、载体DNA分子在连接前去除磷酸基团
        • C、加装同聚尾末端
  • 重组DNA分子的转化与扩增（转与增）
    • 转化原理与技术
      • Ca2+诱导的转化
        • 原理
          • 钙离子与细菌外模磷脂，在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，此时的细胞状态称为感受态
        • 制备过程
        • 感受态细胞的质粒转化
      • 细菌原生质体转化
        • 原理
          • 革兰氏阳性菌接纳外源DNA的主要屏障为细胞壁，则这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后形态）转化方法转移质粒或重组DNA分子
        • 细菌原生质体转化
          • 取0.2-1ml的原生质体悬浮液，假如10-20μlDNA重组链接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液
        • 原生质体的再生
          • 主要目的为重新长出细胞壁，在特殊固体培养基中，内涵脯氨酸与微量元素
      • 电穿孔转化
        • 将待转化质粒或DNA重组连接液，在电穿孔转化仪的样品池中，施加高压电场，在电场作用下，细菌细胞壁与细胞膜产生缝隙，质粒与DNA重组分子便可进入细胞内
        • 操作简单，且对几乎所有含细胞壁的受体细胞有效，但转化率差别大
        • 也可用于质粒消除实验
    • 转化率
      • 每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞分子数
      • 影响因素
        • 载体本身性质
        • 载体空间构象
          • 质粒超螺旋构想转化率最高，酶切后载体空间构象难以恢复转化率大大降低
        • 插入片段大小
          • 片段越大，转化率越低
    • 转化细胞扩增
      • 指转化完成后细胞的短时间培养
      • 目的
        • 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选
        • 扩增和表达载体分子上的标记基因
        • 表达外源基因，便于筛选与鉴定
  • 转化子的筛选和鉴定（检）
    • 载体遗传标记检测
      • 抗药性筛选法
      • 营养缺陷筛选
      • 显色筛选法
    • 克隆DNA序列检测
      • 限制性酶切图谱法
    • 外源基因产物检测
• 第五章目的基因的克隆与基因文库的构建
  • 影响克隆基因的表达因素
    • A启动子的结构
      • 大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区
        • -10区
          • 转录起始位点上游5-10pb,5'--TTGACA
        • -35区
          • 转录起始位点上游25pb，一般由10pb组成，5’---TATAAT
        • 实际中启动子很少具备上述序列完全一样启动子，但越与上述保守序列相似，启动子的表达能力越强
    • B翻译起始序列
      • 子主题
    • C启动子与克隆基因间的距离
• 第六章大肠杆菌基因工程
• 第七章酵母基因工程
• 主题
• 会慢慢修复补充