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毒理学5外源化学物的一般毒性作用
本图介绍了急性毒性作用及其评价、短期、亚慢性和慢性毒作用，希望对大家有帮助！
编辑于2024-02-20 08:15:46- 毒理学
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毒理学5外源化学物的一般毒性作用
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思考题
LD50的毒理学意义以及局限性？
如何设计急性毒性试验？
如何设计亚慢性和慢性毒性试验
毒性作用
一般毒性
基础毒性，毒性综合效应
特殊毒性作用
三致作用、生殖毒性
一般毒性作用(general toxic effects)
定义
在一定条件下，外源化学物质在一定的暴露剂量、时间和方式下对机体产生的综合毒效应。
分类
1、急性毒性
温馨提示
急性接触次数：1次或24h内多次
毒效应出现时间：接触毒物（或者症状出现的时间）
观察时间：7-14天
强度：一次大剂量，症状明显，常发生死亡
目的
求出LD50，毒性分级，评价毒作用强度
观察毒作用表现、强度和死亡，评价毒效应特征、靶器官
总体原则
实验动物
实验前准备
受试物信息
化学结构、分子量
理化性质
实验动物选择
选择原则
2、短期毒性
3、亚慢性毒性
4、慢性毒性
一般毒性评价(evaluation for general toxicity)
按接触化学毒物时间长短所进行的哺乳动物试验以观察毒效应、评价化学毒物综合毒性的试验。根据试验结果对化学毒物的毒性进行评价。
一般毒性评价意义
是毒理学工作中非常重要的内容
指机体一次或24小时内多次（≤3次）接触化学物后，在短期（＜14天）内所发生的毒效应，包括一般行为、外观改变、形态变化及死亡效应。
是毒物安全性评价和危险度评定的基础
对防治毒物中毒、制订标准及管理毒理学等有重要意义
一、 急性毒性作用及其评价
基本概念
急性毒性(acute toxicity)
急性毒性试验(acute toxicity test)
评价外源化学物急性毒作用的试验，是认识和研究其对机体毒效应的第一步，可提供短期接触所致毒作用的信息和资料。
温馨提示！
急性接触次数
一次或24h内多次
毒效应出现时间
接触毒物或症状出现的时间
观察时间
7-14天
强度
一次大剂量，症状明显，常发生死亡
急性毒性试验目的
求出LD50，毒性分级，评价毒作用强度
观察毒作用表现、强度和死亡，评价毒效应特征、靶器官、剂量-反应关系和损害危险性
为其他试验提供接触剂量和选择观察指标依据
为探讨毒作用机制提供初步依据
急性毒性试验方法总体原则
实验动物
染毒途径
染毒剂量
观察周期
观察指标选择、计算方法和评价
急性毒性试验常用的毒性参数有哪些？
LD50/LC50
Zac（LD50 / Lim ac）
LD84/LD16 (或 LC84 / LC16)
剂量-反应曲线斜率
急性毒性试验方法
一、试验前准备
受试物信息
化学结构、分子量
理化性质
人群接触的途径
实验动物选择
选择原则
急性反应与人近似
易于饲养、操作方便
繁殖力较强，数量较大
价格较低，易于获得
物种和品系
啮齿类：小鼠、大鼠
非啮齿类：犬或猴
根据接触途径选择实验动物
首选哺乳动物（大小鼠最常用）
急性皮肤毒性实验：成年大鼠、豚鼠或家兔
急性吸入毒性和经口毒性实验：大鼠和小鼠
实验动物的年龄和体重
刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物
体重变异范围不应超过平均体重的20%
小动物根据体重
大鼠：180-240g
小鼠：18-25g
家兔：2-2.5kg
实验动物的性别
雌雄各半
雌、雄毒效应差异明显，分别求LD50值
特殊试验可做单一性别：生殖与发育毒性
二、试验的实施
实验动物的检疫
检疫期一般5-7天
大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴2-3周
适应新环境，减少条件变化对结果影响
筛检健康状况不符合试验要求的动物
动物禁食
经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食
大鼠、小鼠——隔夜禁食
大动物——每日上午喂食前染毒
染毒2h后提供饲料，禁食时要保障饮水
经口多次染毒可不禁食
动物数量与分组
鼠等小动物：10只/组
狗等大动物：每组6只
分组原则：随机化原则
一般3~7个剂量组（至少3个）
受试物及处理
常用剂型：水溶液、混悬液、油溶液
溶剂和助溶剂基本无毒，与受试物不起反应
水溶性受试物，保持与体内渗透压一致
非水溶性受试物，溶于或悬浮于有机溶剂中
受试物一般应临用前新配
受试物剂量选择
参考新化学物的理化性质
参考相关资料
少量动物较大剂量间隔染毒，找出10%-90%（0-100%）的致死剂量范围，后设计正式实验剂量和分组
根据试验所选的LD50计算方法确定剂量组数
适宜容积（最大容积）染毒
毒性较大（低）的受试物给药量较小（大）
大、小鼠灌胃：1.0ml / 100g 和 0.1ml / 10g体重
给药容积根据染毒途径和实验动物
经口：20ml/kg(空腹动物)
经皮：2ml/kg
静脉：1ml/kg(5min以上)
试验动物的饲养环境
恒定的温度：22±3℃
湿度：30~70%
照度：昼夜各半
饲料合格、饮水合格、垫料合格
染毒途径
常用染毒方法
1、经口(胃肠道)染毒
灌胃：以注射器经导管注入胃内
急性实验多采用灌胃法（大、小鼠常用）
灌胃针：长6～8cm、4～5cm，直径1.2mm、1mm
灌胃针的尖端焊有一中空的小圆金属球
金属球端弯曲成20°，以适应食道生理弯曲度
鼠类的灌胃法
针插入深度
小鼠3～4cm， 大鼠或豚鼠为4～6cm
灌胃量
小鼠0.2～1ml， 大鼠1～4ml，豚鼠1～5ml
用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。
吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下
喂饲：将受试物掺入饲料或饮水中动物自行摄入
2、经呼吸道染毒
吸入染毒
静式吸入染毒
将一定量的易挥发的液态化学毒物或一定体积的气态化学毒物加入到具有一定体积的密闭容器内，使实验动物吸入染毒。
方法：密闭容器中加入易挥发液态或气态毒物
染毒柜体积、动物数、时间：据最低需气量计算
优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠
缺点：氧减少，浓度不稳，经皮吸收，不适合大动物
动式吸入染毒
染毒柜有空气流动，新鲜(污染)空气不断流入(流出)
温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定
随时补充受试物，维持浓度稳定
可采样监测浓度，可持续接触受试物，无时间限制
动式吸入染毒优缺点
优点：受试物浓度和氧分压较稳定
缺点：设备要求高，消耗受试物量很大，操作比较复杂，费时费工
动式吸入染毒方式分类
动式吸入接触（动式染毒）
面罩接触（面罩吸入染毒）
动式吸入染毒装置的组成
染毒柜
机械通风系统
配气系统
气管内注入
经喉插入法、气管穿刺法、暴露气管穿刺法
优点：剂量准确，用量少；形成模型速度快
缺点：易造成损伤，引起死亡；不能发挥上呼吸道防卫作用，与自然吸入有差异
3、经皮肤染毒
液态、气态甚至粉尘状态的化学毒物
多选择家兔和豚鼠，采用动物脊柱两侧皮肤脱毛，局部涂敷受试化学毒物并以玻璃钟罩、油纸或塑料薄膜覆盖固定一定的时间。
脱毛：化学或机械法脱毛（体表面积的10%）
染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法
农药、化妆品、环境污染物、外用药物
常用大鼠、豚鼠
染毒方式
4、注射途径染毒
研究化学毒物的毒作用机制和比较毒性
了解毒代与动力学参数或筛选急救药物
腹腔、静脉、肌内及皮下注射
染毒途径
工业毒物：经呼吸道、皮肤
农用化学物：经口、皮肤、呼吸道
药品：经口、注射、皮肤
食品：经口
环境污染物：经口、呼吸道、皮肤
染毒途径影响受试物急性毒性
吸收速率：静脉注射>呼吸道>腹腔注射>肌内注射>皮下注射>消化道>皮内注射>经皮
同一受试物不同途径LD50大小符合上述规律
染毒途径选择需考虑问题
模拟实际接触的途径和方式
利于不同化学物间结果比较
受试物的性质和用途
受试物毒性评价程序的要求
中毒效应观察
1、中毒体征及发生过程
详细观察和记录动物出现的中毒体征
发生时间
体征发展的经过
各个系统的特征
初步确定急性毒性靶器官
不同表现提供毒性机制的信息
2、死亡情况和时间分布
重点观察和记录死亡时间，特别是最早出现死亡时间及各个剂量组动物死亡数
实验动物的死亡数对LD50值产生明显影响
分析中毒死亡时间分布规律,为研究毒作用机制提供参考
举 例
久效磷经口与腹腔注射染毒，均呈现随剂量增加，死亡时间缩短呈直线负相关，提示致死是化学物原形所致。
过氧化二磷酸二环己酯给大鼠腹腔注射后呈现明显的剂量对数值与死亡时间呈负相关，但给小鼠腹腔注射后，剂量与死亡时间无明显相关。提示可能与该化学物在大鼠和小鼠体内代谢不同有关。
3、体重
反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的量化指标
定期多次（每周1次或2次）称量动物的体重变化
对体重指标的变化要仔细观察和分析
体重变化的原因
影响食欲或消化系统的功能
影响食物的吸收和利用
影响水的摄取
肾功能急性损伤
4、病理形态学变化
死亡动物
大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变
存活动物
观察期结束时应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查
5、观察时间和周期
染毒后即刻开始观察中毒表现和死亡情况
给药当天应连续或多次观察
以后据情况，每天2次或多次观察至结束
观察周期一般为14天
计算LD50以观察周期内各组总死亡数为依据不同化学物引起中毒体征出现时间不同，且引起死亡的时间存在个体差异
速杀型化学毒物仅计算24h的死亡率
三、LD50（LC50）的计算
LD50的几种计算方法
1、改进寇氏法
据剂量对数与死亡率呈S型曲线包含的面积推导出死亡率平均为50%时的剂量
各组实验动物数相等，一般为10只
各组剂量呈等比级数排列，至少有5个剂量组
死亡率：呈正态分布，最低剂量组＜ 20%，最高组＞ 80%，所选剂量对数差值相等
2、霍恩法（Horn）：平均移动内插法
是利用剂量对数与反应率的转换数（概率单位）呈直线关系而设计
固定设4个剂量组，组距分别定为2.15倍或3.16倍，形成两个剂量系列
优点：使用动物数少，结果可查表求出LD50及95%的可信区间，使用方便
缺点：95%的可信区间范围较大，方法精确度不够
3、Bliss法：最大似然性法，最精确的计算方法，但计算麻烦
不必计算LD50法
化学物LD50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大
我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡
经典急性毒性试验的局限性
消耗的动物量大
获得的信息有限
测得的LD50仅仅是一个近似值
仅评价动物死亡和简单的症状观察
不能提供生理学、血液学及化验检查的毒性信息
四、LD50的意义
评价毒物对机体急性毒性大小
为其他毒性实验的剂量选择提供参考
比较不同途径LD50值，获得生物利用度信息
推测人类致死剂量和中毒剂量
五、LD50的局限性
不包括慢性毒性以及未死动物的中毒效应
是一统计值，不能反映某些较敏感个体毒作用
LD50波动大，受性别、年龄、环境等因素影响
同一毒物通过不同途径，其LD50有很大差异
经典急性毒性实验消耗的动物数量大
人和动物的敏感性差异很大
注意
LD50的观察时间短，会漏失对双相死亡现象的认识。如乙酰水杨酸经口染毒：早期抽搐性死亡和后期心血管效应性死亡。提示毒作用部位和机理不同。
急性死亡掩盖某些重要症状，如纳差、无尿、腹泻、便秘、脱髓鞘等，死后尸检不一定能看到形态学改变。
六、急性毒性分级和评价
急性毒性分级用于评价毒物急性毒性强弱，比较急性毒性大小
我国或国际的急性毒性分级标准均存在缺点，因它们主要是根据经验确定，客观性不足
目前还没有全世界公认、统一的毒性分级标准
急性毒性替代试验
固定剂量法
选择5、50、500和2000㎎/㎏剂量。以明显的毒性体征作为终点进行评价
急性毒性分级法
以死亡为终点的分阶段试验法。每阶段3只，据死亡数，经2-4阶段可判断急性毒性
上-下移动法或阶梯法
节省动物，估算LD50及其可信限
二、局部刺激试验和皮肤致敏试验
局部刺激试验：眼、皮肤
皮肤致敏试验
三、短期、亚慢性和慢性毒作用
基本概念
短期重复剂量毒性（短期毒性）
实验动物或人连续暴露外源化学物14-30天所产生的中毒效应。
功能：具有预备和筛选的性质，尤其是28天短期毒性试验，基本成为一种初步估计长期暴露可能引起毒效应的经济实用的短期重复毒性试验。
亚慢性毒性
指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的毒物所产生的中毒效应。
接触时间：单次染毒和10%动物寿命范围(1～6个月)
较大剂量：是相对低剂量而言，没有明确剂量范围下限，上限一般小于急性LD50
慢性毒性(chronic toxicity)
指人和试验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量化学毒物所产生的毒性效应。
“长期” ： 一般是指2年。大鼠相当于终生染毒，兔相当于生命期的36%，犬为20%，猴为13%。
为什么会发生慢性毒性作用？
蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础
是评定化学物是否引起潜在慢性中毒论据之一
是制定卫生限量标准时安全系数的一种依据
何谓蓄积毒性作用？
蓄积作用(accumulation)：当化学毒物反复多次给动物染毒、化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留。
蓄积作用分类
物质蓄积( material accumulation )
实验动物反复多次接触化学物后，用化学分析方法能测得机体内存在该化学物或其代谢产物
功能( 损伤 )蓄积( functional accumulation)
有的化学物在长期接触后，机体内虽不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用。
蓄积系数(accumulation coefficient)
是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值，即
亚慢性和慢性毒作用试验目的
观察长期暴露毒效应谱、特点、靶器官和机制
观察长期暴露受试物的毒作用的可逆性。
探讨剂量-反应关系，确定NOAEL和LOAEL
亚慢性试验可为慢性试验提供合适观察指标
比较不同动物差异，为结果外推到人提供依据
试验设计
实验动物
品系：与人代谢、特性接近、对毒物敏感品系
种属：啮齿类 和非啮齿
性别：雌雄各半
种系：纯系动物，如Wistar和SD品系大鼠
试验动物的选择
1、种属和品系
啮齿类和非啮齿类：大鼠、犬和猴
经皮毒性试验，可用兔或豚鼠
大鼠常用Wistar和Sprague-Dawley
犬多选用Beagle犬
2、性别、年龄和动物数
雌雄各半
选择离乳不久的动物,大鼠6-8周龄（体重80-100g）
同组动物体重相差不超过平均的10%,组间不超过5%
大、小鼠每组不少于20只,犬、猴每组不少于6只
3、微生物学寄生虫学等级和饲养环境
实验动物等级
普通级
清洁级
无特定病原体级（SPF级）
无菌级
动物饲养环境
严格控制人员、物品和环境空气的进出
合理饲料，洁净饮水，无污染垫料和笼具
不同项目的试验应分室进行
人工控制昼夜交替
用清洁及以上等级大小鼠，饲养在屏障环境内
保持符合规范的温度、湿度、噪声和照度等
动物染毒条件
染毒途径
经口、呼吸道、皮肤和注射染毒
染毒频率
每天1次。呼吸道（2-6h）、皮肤（4-6h）
染毒期限
短期重复（28-32d）、亚慢性（1-3m）、慢性（大于6m）
工业毒理学—— 3－6个月
食品毒理学—— 6个月－1年
环境毒理学—— 6个月－1年
致癌试验—— 接近或等于动物的预期寿命
剂量选择和分组
设3个剂量组和1个阴性（溶剂）对照组
高剂量组有明显毒性或10%内死亡，可取1/20-1/5 LD50或急性阈剂量
低剂量组应无中毒反应，相当于NOAEL
高低剂量组间设置1个中剂量组，剂量相当于LOAEL
高、中、低剂量组距以3-10倍为宜，不少于2倍。
对于药物，大鼠染毒量可用人临床拟用剂量的10、30和100倍，非啮齿类可用5、15、50倍。
在实际工作中，由于受试物多样性和试验中多种因素的变化，亚慢性毒性试验的剂量设计和确定是很不容易的，需要具有丰富的毒理学经验。）
毒作用观察指标
1、 一般性指标：外观、行为
一般性指标
指外观体征和行为活动，粪便性状、食量及体重变化等，能综合反映毒物对机体的毒作用，是敏感的综合毒效应指标。
外观体征、行为活动
记录各症状出现的时间和先后次序
食欲、活动、被毛、分泌物、呼吸等
留意动物被毛的光洁度与色泽、眼分泌物、呼吸、神态、行为等
动物体重
是一个客观指标，反映对生长发育及一般状态的影响
受试组体重增长比对照低10%，提示受试物引起的毒效应
各剂量组体重改变有剂量-反应关系，肯定是一种毒性效应
每周称重一次，3个月后每2周称重一次
食物利用率
动物每食入100g饲料所增长的体重克数（g体重/100g饲料）。有助于了解化学物的毒性效应，尤其将体重指标和食物利用率结合起来分析。
如果受试物影响食欲，则每日进食量减少，体重增长受影响，但食物利用率不一定改变；如果受试物干扰了食物的吸收或代谢，虽然不一定影响食欲，但体重增长却减慢，因而食物利用率也会有改变。
2、实验室指标
包括：血、尿常规和血液生化指标检测
血液学检查
包括红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数及分类、血小板计数、凝血时间等。
血液生化检查
血清天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、尿素氮、总量白、白蛋白、血糖、总胆红素、肌酐、总胆固醇等。
尿液检查指标
外观、pH值、蛋白、糖、潜血和沉淀物镜检等，可提供与毒物有关的靶器官毒性和中间代谢产物的信息。
目的：发现受试物所致器官损伤和功能紊乱
检查重点：肝、胃、血液
注意！
不影响实验动物生理功能的最大取血量为其总血量的10%
总血量约为50ml/kg，0.3kg的大鼠约有15ml血液，一次取血量不应超过1.5ml
3、系统尸解和病理组织学检查
试验结束时活杀实验动物，作系统解剖，进行详细的肉眼检查，测定脏器重量并作组织病理学检查。
试验中间死亡或处于濒死状态的动物，应作及时的系统尸解和病理学检查。
脏器系数
某脏器湿重与单位体重的比值，通常是每100g体重中某脏器所占的质量，表示为脏器质量（g）/体重(100g)。该指标适用于实质性脏器，若某脏器的脏器系数增大或减小，则反映该脏器的肿大或缩小，如增生、充血、水肿、萎缩等变化。
病理学检查目的
确定毒物毒作用的靶部位、损害性质和程度
寻找化学毒物与病理改变的剂量-效应关系
为了解化学毒物的毒效应及其机制提供依据
病理学检查内容
大体检查
常规病理组织学检查
酶组织化学检查
免疫组织化学检查
细胞超微结构检查
4、其他特殊指标检查
根据受试物毒性资料、试验中的观察等增加一些检查项目
推测可能有心血管系统毒性，进行心电图、血压、眼底检测
对神经系统有影响，进行神经行为、神经反射等检查
影响电解质、微量元素代谢，测血钙、磷等
增加眼科、骨髓象检查等
增加酶组织化学检查、免疫组织化学检查
增加细胞超微结构检查
实验过程注意点
试验前的观察指标作为自身前后对照基础
染毒期动态观察，与对照比较，消除年龄差
对各项观察指标的检测严格实施质量控制
染毒期死亡或终止时出现肿物，作病理检查
结果评价
剂量-反应关系：明确化学物毒效应
毒反应重现性：确定毒效应与毒物有关
相关指标变化：与对照不一致，可确定有关
组间差异大小：反映关联程度
时效关系：差异随染毒时间延长而增大
性别差异：代谢酶可能不一致
历史对照：反映正常生物学变异
可识别异常的阴性对照
发现低发生率事件
染毒组指标变化与对照组比较有统计学意义，但在历史性对照范围内，该差异不能确认为与受试物有关的效应