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毒理学8外源化学物的生殖与发育毒性作用
小结
概念：生殖毒性、发育毒性、不良妊娠结局
生殖毒性：如何开展生殖毒性评价、一代/多代生殖毒性、三段生殖毒性
发育毒性：致畸作用特点、致畸实验设计和评价、发育毒性筛选实验
目的要求
掌握生殖毒性与发育毒性的基本概念
掌握生殖、发育毒性评价方法
熟悉生殖发育毒性靶器官与特点
了解母体毒性与发育毒性的关系
一、概述
(一)相关概念
生殖和发育
精子发生、卵细胞形成、配子释放、受精、卵裂及胚泡发育、着床、胚胎发生、胎儿发育、分娩和哺育过程。
1.生殖毒性(reproductive toxicity)
外源化学物对生殖过程的影响和损害作用。表现为生殖系统器官(睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫等)的变化，动情(月经周期)、性行为和功能的影响，以及对生殖力和生殖(妊娠)结局的影响等。
生殖毒理学(reproductive toxicology):
研究外源化学物损害生殖过程的机制、规律及其毒作用对后代影响的学科
生殖(reproduction)
是指生物体产生和繁衍后代的生理过程。
2.发育毒性(developmentaltoxicity)
理化因素或母体健康状态对发育中的子代造成的从胚胎或胎仔发育到出生后青春期前的有害作用
发育毒性的表现
1、发育生物体死亡
早早孕丢失、自然流产、死胎
2、生长迟缓
低于正常均值的2个标准差
3、功能缺陷
生理、生化、免疫、行为、智力等异常
4、结构异常
畸形和变异
5、出生缺陷
婴儿出生前的发育障碍(形态结构或功能缺陷)
发育毒理学(developmental toxicology)
研究这些有害影响的原因、作用机制及其规律和评价的科学
3.致畸作用
发育毒物影响胚胎发育和器官分化，使子代出现先天畸形的作用。
畸形
发育生物体的解剖学形态结构的缺陷。可对生长、发育、生理功能、寿命产生有害影响。
致畸物
引起子代畸形的环境因素。
4.不良妊娠结局
指妊娠后不能分娩外观和功能正常的子代，包括:流产、死胎、死产、宫内发育迟缓、发育异常、新生儿和婴幼儿期死亡等。
(二)生殖发育毒性的靶器官与特点
生殖发育毒性靶器官
整个生殖与发育过程多涉及的细胞或器官都可能成为外源化学物毒作用的靶
按表现器官分为（搜概念）
亲性腺作用
亲胚体毒性
亲胎盘毒性
生殖发育毒性作用途径
直接作用
干扰生殖发育过程任何环节，并照成损害作用
间接作用
干扰神经内分泌功能，通过下丘脑-垂体-性腺作用于生殖功能
生殖发育毒性特点
损害特点
损害作用多种多样
生殖和发育过程较为敏感
亲代和子代都受影响
二、生殖毒性及其评价
评价方法
（一）人群流行病学调查
目的
分析父体和母体、孕体特定暴露与生育结局之间的关系
评价化学物对男性生殖功能
通过精液调查、男工妻子生育史及其子代发育情况
评价化学物对女性生殖功能
月经情况、妊娠结局、子代发育
优点
不存在种属差异，较动物试验、体外试验更有说服力
可靠的流行病学调查应该为
由不同研究团队在不同时间用不同调查方法、在不同人群、不同地点得到一致的结论
人群流行病学调查-举例
外源化学物1960-1961年联邦德国爆发了短肢畸胎主要表现为肢体的长骨缺损，而相当正常的或退化的手和脚长在（或靠近)躯干，像海豹的阔鳍一般,因此也叫海豹肢。
描述性研究
发病特点：无家庭聚集性
时间分布：1959~1961年，西欧国家的短肢畸形病例数逐年增加，1960年底到1961年达高峰
人群分布：男性和女性胎儿皆可罹患，异卵双胞胎同时受害
病例报告：汉堡新生儿短肢畸形发生率为0.17%，病例均有反应停用药史
分析性研究
病例对照研究：46例短肢畸胎中，有41例的母亲服用过反应停，而在300名正常婴儿的母亲中，无一人在妊娠第4~9周服用反应停，0R=93.5
队列研究：调查了24名妊娠0~8周服用反应停的妇女，以21485名妊娠早期未服用过反应停的妇女为对照，服用反应停组婴儿出现肢体畸形的危险性是未服用组的175倍
干预试验
（二）（整体动物）生殖毒性试验
揭示外源化学物对哺乳动物生殖的有害影响，结合其他资料，预测其对人体可能造成的生殖危险
可全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响
缺点
动物推导至人存在不确定性
生殖毒性试验-评价依据
受孕情况：受孕率
妊娠过程情况：正常妊娠率
子代动物分娩出生情况：出生存活率
授乳情况：哺育存活率
断乳后发育情况：功能及行为改变
生殖毒性试验方法原则
动物选择:以哺乳动物为试验对象
分组与剂量选择:设3个剂量组和适当对照组
动物接触途径与频率:参照人类实际接触途径
检测指标:与试验类型有关
毒性试验分类
三段生殖试验
生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验） (I)
配子发生、交配行为、生育力、胚体着床
动物
首选大鼠，每组每性别16-20
给药时间
交配及受孕检查
交配2-3周，交配比例1:1
观察项目
染毒期间雌雄亲代(FO) 体征、死亡、体重、摄食量、镜检雌雄阴道图片
结果评定
受影响窝数比、受影响胎体平均百分率、受影响胎体总数比
注意事项
交配前给药期的确定(I) （了解）
雌性动物动情周期的预筛和评价(I)
雄性动物处死解剖时间的确定(I)
分开进行雄性和雌性生育力试验(I)
精子检查项目必须当天完成(I)
举例1
未开展动情周期预筛时，段生殖毒性试验在交配期发现一只阴道闭锁动物。
举例2
高剂量组20只动物，交配期前死亡3只，交配期17只动物在交配期前5天仅12只交配成功，为70.6%。通常5天内的交配率为90%以上。此时做好延长交配期的准备，增加雄性与未交配雌性动物再次交配。但在2周内，又有4只动物交配成功，达到90%以上，所以未延长交配期。结果反映出来是交配成功所需时间明显延长。
举例3
精子检查包括活动度，精子计数和精子畸形，人工或机器进行精子畸形检测，精子样品冷藏过夜，第二天发现大部分精子均出现断头。所以定精子检查必须当天完成。
胚体-胎体毒性试验 （致畸试验）(II)
出生前和出生后发育毒性试验 (围生期毒性试验) (III)
目的：检测从胚胎着床到幼仔离乳给药对妊娠/哺乳的雌性动物以及胚胎和子代发育的不良影响
动物：首选大鼠
亲代F0
常规指标，死亡及临床征状，体重，摄食量
分娩观察，哺乳及筑巢行为，大体解剖
子代F1
生长发育：死亡及临床征状，体重，摄食量
外形分化：门齿萌出，睁眼，耳廓分离
性别分化：雌性阴道开口，雄性龟头包皮腺裂开
反射功能：平面翻正反射，空中翻正反射
感觉功能：听觉，视觉
行为记忆：自发活动，主动运动，学习记忆
生殖能力评价
一代生殖试验
一代生殖试验：实验动物在出生或断乳时处理，仅对一个生殖周期进行观察。
染毒时间：亲代(F0)动物直接接触受试物，子一代 (F1)将在宫内及经哺乳接触受试物
观察时间：主要评价受试物对亲代青春期前后和成年动物亚慢性暴露的影响(A-F)
两代（多代）生殖试验
多代生殖试验：整个生命期内接触受试物，同一指标观察两代或三代，可弥补一代生殖试验中的不足 (未能观察生殖毒性在子代的表现)，更符合人类长期低剂量的情况。
染毒时间：F0交配前-F1断乳，F1断乳后(交配前)-F2断乳后
观察时间：多代生殖周期的生殖毒性(A-F)
优点：直接和间接生殖毒性
一代与多代生殖试验的主要区别是染毒时间，观察时间
（三）体外试验等替代试验
三、发育毒性及其评价
（一）影响发育毒性的因素
1.母体因素
①遗传
孕母的遗传结构是孕体发育结果的一个决定因素
唇腭裂的发病率取决于母体基因型，白人大于黑人
②疾病
直接或间接经胎盘的感染对孕体有不利的影响
巨细胞感染与胎儿死亡，小头畸形，心智发育延滞，盲目和耳聋有关
母体发热与中枢神经系统畸形有关
③营养
蛋白质，热量，维生素，微量元素及酶辅因子的缺乏对妊娠不利
④应激
不同形式的母体毒性可能通过诱导生理学的应激反应产生发育毒性
2.胎盘毒性
胎盘是孕体进行气体交换、营养吸收和废弃物排泄的场所
胎盘能分娩一些重要的激素
胎盘屏障功能
3.母体毒性
化学毒物对孕母产生的损伤作用，表现为体重减慢，功能异常，临床症状，甚至死亡。
目前常用增重减慢和死亡率来表示
4.父源性毒性
指药物、饮酒、吸烟、环境污染物等经父亲对发育个体产生的不良影响。
（二）发育毒性的敏感期及终末点
致畸的基本原理
不同发育阶段发育特点不同
不同系统和器官的发育不完全同步
不同的化学毒物作用模式不同
不同发育阶段的发育毒作用特点
受精期，着床期，器官形成期，胎儿期，围生期，出生后发育期
(1)受精期
时间：配子发生和受精过程
发育毒性：生殖细胞受损，不孕不育
(2)着床期
时间：从受精卵至完成着床
发育毒性：着床前丢失，偶有畸形
(3) 致畸敏感期（器官形成期）
时间：着床直到硬腭闭合，人是3-8周
发育特点：细胞增殖，细胞移动，细胞间交互作用和形态发生的组织改造。
致畸敏感期：此时容易受致畸物的作用而诱发器官结构的缺陷
致畸特点：时间特异性及致畸物特异性发育毒性:畸形，生长迟缓，胚胎死亡
致畸毒性特点
1、有致畸敏感期
器官形成期对致畸原特别敏感。不同器官有他特定的敏感期。掌握不同器官的特别敏感期，可以分别深入观察受试物对不同器官的作用和致畸机理。
2、致畸作用存在显著的种属差异和个体差异
3、剂量一效应(反应)关系复杂
相同剂量染毒时期不同，或着不同剂量引起的畸形类型和畸形发生率有很大差异。
反应停的致畸敏感期（末次月经后第34-50天）
35-37天：耳朵畸形、听力消失
39-41天：胎儿上肢缺失
43-44天：双手呈海豹样3指畸形
43-44天：胎儿拇指畸形
(4)胎儿期
时间：器官形成结束后直到分娩
发育特点：组织分化，生长和功能的完善，包括形态结构和生化功能的成熟
毒性特点：影响组织器官生长和功能成熟
发育毒性：生长迟缓，功能障碍，经胎盘致癌，偶见死胎
(5)围生期
时间：怀孕第28周到出生后一周
对致癌物最敏感的时期
(6)出生后发育期
时间：自胎儿娩出脐带节扎时开始，包括新生儿期、婴儿、幼儿、学龄前直到青春发育期
发育毒性：发育免疫毒性，神经行为发育异常和儿童期肿瘤
（三）发育毒性的剂量反应模式和阈值
剂量反应模式
1、常见反应模式
较大剂量致全窝胚胎死亡，一般剂量下正常、畸形和生长迟缓共存，毒性反应随剂量增加而增加
2、强致畸剂模式
在远低于胚胎致死剂量下即出现致畸，甚至全窝致畸，常伴有生长迟缓。
3、非致畸作用模式
在低剂量引起生长迟缓，高剂量引起胚胎死亡(全或无)，无畸形发生。
（四）发育毒性的评价
致畸实验 ( II）胚胎-胎仔发育毒性试验
目的：研究妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合给药，评价药物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响。
动物：包括大鼠和家兔
母体畸胎出现率
出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率
活产幼仔平均畸形出现数
根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数
畸形出现率
作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率
剂量选择时预实验很重要
交配成功雌性动物的获得
限制摄食对照组的设立
重视历史对照数据累计
诺酮类抗生素，未进行预试验，参照刚结束的另外一个厂家的同类产品设置，0、100、300和1000mg/kg四组，结果1000mg/kg组全部为吸收胎、死胎。又追加600mg/kg组，平行设部分0、100、300mg/kg组。
280克至300克左右的雄性大鼠，首次授精的雌性动物用于GLP试验，结果各组交配成功的动物中怀孕动物数不足10只。整个试验重做。
抗糖尿病药物的大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验
供试品明显降低动物摄食量
怀孕动物摄食量减少可能导致畸形变异发生率增加
采集孕鼠血液及胎仔血液进行药物浓度分析，评价药物是否透过胎盘
设立限制摄食对照组
发育毒性替代试验
发育毒性体外替代试验
优点：快速，简单，可探讨机制
缺点：特异性不高，缺乏公认标准
细胞培养试验
体外胚胎培养试验
短期体内试验
体内初筛试验(C/K试验)
原理
大多数出生前的损害在出生后表现为存活力下降和(或)生长障碍，在仔鼠出生后，观察其外观畸形、胚胎死亡、生长迟缓等生长发育指标，而不进行常规试验中的内脏和骨骼检查
优势
使用动物数量少，试验周期短，可提供对生殖或发育毒性可能产生的影响初步信息。
体外初筛试验
大鼠胚胎肢芽微团实验
从第11天的大鼠胚胎取得脑和枝芽细胞微团，加入受试物培养，观察细胞分化情况，评价化学物的细胞和发育毒性。
大鼠全胚胎培养试验
取出第9-10天大鼠胚胎，在培养液中培养，加入受试物，观察发育情况。筛选化学物的发育毒性/探讨剂量反应关系和作用机制初筛化学物的发育毒性
小鼠胚胎干细胞实验
利用小鼠胚胎干细胞在特定条件下可定向分化为机体多种细胞的能力，将其作为生物测试系统，用于细胞分化，组织形成过程的发育毒性研究。
人群研究
包括流行病学调查，个别案例和群体事件报告
通过病例一对照研究或列队研究来寻找因果关系
发育毒物的确定和危险性评价
确认人类致畸物的标准
某种特异缺陷或几种缺陷并发的频率突然增加
缺陷的增加与某种已知的环境改变相关联
在妊娠的特殊阶段已知暴露于某种环境的改变，产生有特征性的缺陷综合征
缺少妊娠时引起特征性缺陷婴儿产生的其他共同的因子
