《生化》第9版：12、RNA的合成

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RNA的合成

• 原核生物RNA合成
  • 1、DNA的复制与RNA转录的比较
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    • cDNA特指在体外经逆转录与RNA互补的DNA链
  • 2、转录时的碱基配对原则
    • 碱基配对
      • 稳定性：G≡C＞T=A＞A=U (DNA复制为A=T，G≡C)
    • 方向相反
      • DNA模板链方向为3'→5'，转录产物RNA方向为5'→3'
  • 3、原核生物RNA合成的转录体系
    • （1）转录模板——不对称转录
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      • 模板链
        • 也称：有意义链、Watson链（记忆：Mo-W）
        • 转录时能作为RNA合成模板的一股单链（因为RNA成链方向的限制，模板链方向只能是3′→5′）
      • 编码链
        • 反义链、Crick链（文献刊出的DNA序列）
    • 原料
      • NTP
    • (2)RNA聚合酶
      • （RNA pol，DNA依赖的RNA pol），Mg2+为辅基
      • ①RNA pol能启动RNA链的合成
        • 作用
          • RNApol能催化RNA的转录，该反应以DNA为模板，以NTP为原料，通过在RNA的3′-OH端加入核苷酸，延长RNA链，而合成RNA
        • 特点
          • A、DNA pol复制时需要RNA引物存在，但RNA pol不需要引物
          • B、碱基配对原则—A-U、G-C、T-A
      • ②原核生物RNA聚合酶
        • 形态
          • 原核RNA pol是由5种亚基组成的六聚体蛋白质（a2ββ'ωσ）
            • 八版前为五聚体，没有ω亚基
        • 全酶
          • a2ββ′ωσ参与转录起始，σ只参与转录起始，不参与转录延长
            • σ的功能是辨认转录起始点
        • 核心酶
          • a2ββ'ω参与转录全过程
        • A、各亚基的功能
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            • ρ因子参与转录终止
        • B、原核RNA聚合酶的抑制剂
          • 利福平
            • 利福平能特异性地结合RNA聚合酶β亚基
            • 抑制结核杆菌的转录，而用于结核杆菌的治疗
            • 记忆法
              • 利福平与RNA pol的亚基结合——利比(B）亚
    • 某些蛋白质因子、必要的无机离子（Mg2+、Zn2+）
  • 4、启动子一—RNApol结合到DNA的启动子上启动转录
    • （1）操纵子
      • 定义
        • 对于整个基因组来讲，转录是不连续、分区段进行的
        • 每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子
      • 组成
        • 操纵子包括若干个基因的编码区，及其上游的调控序列
    • （2）启动子
      • 定义
        • 启动子是最初结合RNA pol的一段模板DNA序列，也是决定转录起始点的关键部位。
        • 原核生物以RNA pol全酶结合到DNA的启动子上而启动转录，由RNA pol的σ亚基辨认DNA上的启动子
      • 转录起点（TSS）
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        • 转录起点TSS以开始转录的5′-端第一位核苷酸位置转录起点为+1，用负数表示其上游的碱基序号
      • -10区和-35区
        • A-T比较集中
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        • 全酶中σ亚基识别-35区，再滑动到-10区，继续滑动至转录起点
        • 全酶转录第一个核苷酸后脱落σ亚基，由核心酶催化延长
  • 5、转录过程—起始+延长+终止三阶段
    • (1)转录起始
      • 转录起始所需酶
        • 转录起始需要RNA pol全酶，转录延长仅需核心酶
      • 转录起始复合物
        • RNA pol全酶、DNA模板、与转录起点配对的NTPs（大量NTP）
      • 转录起始分三步
        • ①RNA pol识别并结合启动子（闭合转录复合体）：-35区→-10区
          • A、σ亚基辨认转录起始点，即-35区的TTGACA序列，接着RNA pol向-10区移动
          • B、β′亚基与-10区的TATAAT序列紧密结合，然后跨过转录起始点，开始转录
        • ②DNA双链打开：-10区
          • 闭合转录复合体成为开放转录复合体，开始转录
            • 转录过程DNA双链解开的范围都很小
        • ③第一个磷酸二酯键的形成：转录起始点（TSS/+1）
          • 转录起始不需要RNA引物，两个与模板配对的相邻核苷酸，在RNA pol催化下，生成3',5'-磷酸二酯键
    • （2）转录延长
      • RNA pol核心酶
        • 转录起始需RNApol全酶的参与，延长需核心酶参与
        • 当第一个磷酸二酯键形成后，σ亚基从转录起始复合物上脱落，由RNA pol核心酶催化RNA链的延长
      • 原核转录延长与翻译同时进行
        • 原核RNA转录与蛋白质合成同时进行，保证了转录、翻译都高效率进行。
        • 真核生物有核膜将转录、翻译过程在细胞内的不同区域，转录、翻译不会同步发生
    • （3）转录终止（ρ=Rho）
      • 依赖ρ因子
        • ρ因子能结合RNA，且对polyC（聚胞苷酸，应为多个C）的结合力最强
        • 当转录产物RNA的3′-端出现较丰富的C时，ρ可识别产物上的这一终止信号，并与之结合， 导致ρ因子和RNA pol构象改变，RNA pol的移动停顿，转录终止
      • 非依赖ρ因子
        • 当转录产物RNA的3'-端出现多个连续的U时，上游的一段特殊碱基序列又可形成茎环结构时，转录终止
• 真核生物RNA合成
  • 1、真核生物RNA聚合酶——RNA pol
    • （1）种类
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        • ①记忆方法
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      • 鹅膏蕈碱
        • 来自毒蘑菇鬼笔鹅蕈的真菌毒素
          • 能抑制RNA pol Ⅱ、Ⅲ
      • ②注意比较真核RNA pol
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    • （2）真核生物RNA pol的结构
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      • 两个大亚基+十几个小亚基
    • （3）羧基末端结构域（CTD）
      • RNA pol Ⅱ羧基末端
      • 概念
        • RNA pol Ⅱ羧基末端有一段共有序列Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser样的七肽重复序列片段
      • 特点
        • 所有RNApol Ⅱ均有CTD，只是7个AA共有序列的重复程度不同
      • 功能
        • CTD对于维持RNA pol Ⅱ的催化活性是必需的，体内外实验证明，CTD的磷酸化在转录起始中起关键作用
        • 转录起始阶段——RNA polⅡ的CTD非磷酸化
        • 转录延长阶段——RNA polⅡ的CTD许多Tyr、Ser残基被磷酸化
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      • 其他
        • RNA pol I、RNA pol Ⅲ没有CTD
    • (4）启动子
      • RNA polI、Ⅱ、Ⅲ分别使用不同类型的启动子
      • 分别为I类、Ⅱ类、Ⅲ类启动子
        • I类启动子
          • 富含GC碱基对，主要编码rRNA的基因
        • Ⅱ类启动子
          • 含有TATA盒，主要转录mRNA
        • Ⅲ类启动子
          • 包含A盒、B盒、C盒，主要编码5S-rRNA、tRNA、U6snRNA的基因
  • 2、真核生物的转录过程
    • 
    • （1)真核转录起始——受顺式作用元件、转录因子的调控
      • ①顺式作用元件
        • 顺式作用元件是指位于编码基因两侧（主要是上游），可调控自身基因表达活性的DNA序列
        • 包含启动子、启动子上游调控元件、增强子、绝缘子、沉默子等
          • 增强子（转录激活因子） 沉默子（转录抑制因子） 绝缘子（阻碍增强子或沉默子对启动子的作用）
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        • 启动子
          • 核心序列
            • 为TATA，称TATA盒或Hognest盒，TATA=TATAAAA
              • 与转录起始前复合物结合，启动转录
          • 上游元件
            • 是位于TATA盒上游的DNA序列，如CAAT盒、GC盒
              • 结合相应蛋白因子改变转录速率
      • ②反式作用因子（TF）
        • 定义
          • 能直接或间接识别和结合启动子、及其上游调节序列等顺式作用元件的蛋白质，称为反式作用因子(TF）
          • 包括：通用转录因子、特异转录因子
        • 意义
          • 真核不同的RNApol需要不同的TF配合，完成转录起始、延长
          • 相对应于RNA polI、Ⅱ、Ⅲ的TF，称为TFI、TFⅡ、TFⅢ
          • 除TF I D是通用的外，大多数TF都是不同的RNA pol所特有的
        • A、通用/基本转录因子
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        • B、上游因子和特异转录因子
          • 上游因子
            • 指与启动子上游元件（GC盒、CAAT盒）等顺式作用元件结合的转录因子
              • Sp1结合到GC盒，C/EBP结合到CAAT盒。
            • 上游因子调节通用转录因子与TATA盒的结合、RNApol在启动子的定位及起始复合物的形成，从而协助调节转录效率
          • 特异转录因子
            • 是在特定类型的细胞中高表达，并对一些基因的转录进行时间和空间特异性调控的转录因子
            • 与远隔调控序列如增强子等结合的转录因子是主要的特异转录因子
      • ③转录前起始复合物(PIC）
        • 特点
          • 真核RNA pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子
        • 顺序
          • 首先
            • TF Ⅱ D的TBP亚基结合TATA盒
          • TFⅡA→TFⅡB→TFⅡF→RNA pol→TFⅡE→TFⅡH→形成PIC
    • （2）真核生物的转录延长
      • 延长过程
        • 与原核相似：在RNA pol催化下，按3′→5′方向，合成磷酸二酯键，因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象
      • 核小体变化
        • 转录伴随高级结构变化，RNApol前移处存在核小体移位、解聚现象
    • （3）真核生物的转录终止
      • 转录终止
        • 真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相关的
      • 终止
        • 转录终止的修饰点
          • 在可读框的下游，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有许多GT序列
        • 1、转录越过修饰点后，hnRNA被切断，随即加poly A和5′帽
          • 模板链上没有多聚胸苷酸，故poly A尾（3′端）是转录后才加进去的
          • 帽子结构的功能是保护mRNA免受降解
        • 2、越过修饰点后，转录并不随即终止，下游的RNA继续转录，但很快被RNA酶降解
  • 3、真核生物hnRNA的加工和降解
    • 定义
      • 真核转录产物是初级RNA转录物，几乎所有初级RNA转录产物均需经过加工，才能成为具有功能的成熟RNA
    • 部位
      • 加工主要在细胞核中进行
    • 种类
      • 转录产物mRNA、tRNA、rRNA均需加工修饰，才能用于翻译
      • RNA pol I转录45S rRNA，Ⅱ转录hnRNA→mRNA，Ⅲ转录tRNA
    • (1）mRNA转录后的加工修饰
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      • 5’-端加帽
        • 定义
          • 指在前体mRNA（hnRNA）5'-端加7-甲基鸟嘌呤核苷的帽结构
        • 反应
          • 5-加帽过程是由加帽酶（鸟苷酸转移酶）、甲基转移酶催化的
        • 功能
          • 5′-端的帽结构可使mRNA免遭核酸酶的攻击
          • 能与帽结合蛋白质复合体结合，参与mRNA和核糖体的结合，启动翻译过程
      • 3'-端加尾
        • 定义
          • 指在前体mRNA(hnRNA）的3'-端加上多聚腺苷酸尾（polyA）
        • 功能
          • polyA尾可维持mRNA作为翻译模板的活性，增加mRNA本身的稳定性。
          • 真核生物在胞质内出现的mRNA，其polyA长度为100~200nt，polyA长度与mRNA的寿命呈正相关
        • 反应（先切后加）
          • 核内完成，尾部修饰、转录终止同时进行：先由核酸内切酶切去hnRNA3′-端的一些核苷酸，然后加入polyA
          • 断裂点信号序列——AAUAAA（特异★）、富含G和U（非特异）
      • ③前体mRNA的剪接——去除内含子、连接外显子
        • hnRNA
          • 是mRNA未成熟的前体，包括外显子、内含子
            • 成熟mRNA由外显子串联连接而成
          • 内含子
            • 非编码序列；转录但不被翻译的序列
              • 隔断基因的线性表达，而在剪接过程中被除去
          • 外显子
            • 编码序列，被转录也被翻译的序列
              • 在断裂基因及初级转录物出现，表达为成熟RNA的核酸序列
        • A、内含子形成套索RNA——剪接的第一步
          • 概念
            • 剪接是指将hnRNA的内含子剪切除去，将外显子连接起来的加工过程
          • 套索RNA的形成
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            • 剪接首先涉及套索RNA的形成——即内含子区段弯曲，使相邻的两个外显子相互靠近而利于剪接
        • 剪接
          • B、剪接部位——内含子在剪接位点处被剪除
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          • C、剪接过程——两次转酯反应（不耗能）
            • 第一次
              • 内含子分支点A的2-OH作为亲核基团，攻击外显子1的5'-剪接位点的磷酸基团，导致外显子1与内含子之间的磷酸二酯键断裂，外显子1的3'-OH游离出来
            • 第二次
              • 外显子1的3'-OH作为亲核基团，攻击内含子3'-剪接位点的磷酸基团，导致外显子2与内含子之间的磷酸二酯键断裂
            • 连接
              • 内含子以套索形式被剪切下来，同时外显子1与外显子2相连接
          • D、剪接场所——剪接体
            • 为一种超大分子复合体，由5种RNA、150种蛋白质装配而成，剪接体的装配需要ATP提供能量
            • 核小RN（snRNA）
              • 5种RNA分别是U1、U2、U4、U5、U6，统称为核小RNA(snRNA），长度100~300nt，分子中的碱基以U含量最丰富
            • 核小核糖核蛋白颗粒（snRNP）
              • 每种snRNA分别与多种蛋白质结合，形成5种核小核糖核蛋白颗粒(snRNP)。
              • U1、U2-snRNP分别与内含子5'-端、分支点结合，随后U4、U5、U6加入，形成完整的剪接体
        • 拓展：siRNA诱导mRNA降解，miRNA调控基因表达，snoRNA(核仁小RNA）参与rRNA的加工修饰
        • E、前体mRNA分子有剪切和剪接两种模式
          • 剪接
            • 是指剪切后，又将相邻的外显子片段连接起来
          • 剪切
            • 是指剪去某些内含子后，在上游的外显子3′-端，再进行多聚腺苷酸化，不进行相邻外显子之间的连接反应
        • F、前体mRNA分子的可变剪接
          • 定义
            • 同一hnRNA，在不同组织中被剪接为具有不同编码信息的mRNA，导致翻译生成不同的蛋白质产物的剪接方式
          • 举例
            • 甲状腺中的降钙素、脑中的降钙素基因相关肽（CGRP）来自同一个初级转录本（hnRNA）。
            • 
      • ④mRNA的编辑
        • 是指对基因的编码序列进行转录后加工。有些基因的蛋白质产物的氨基酸序列与基因初级转录产物的序列并不完全对应，mRNA上的一些序列在转录后发生了改变，称为mRNA编辑
        • 举例
          • 人类基因组上只有一个ApoB的基因，转录后发生RNA编辑，编码产生的ApoB蛋白却有2种
          • ApoB翻译产物
            • 一种是ApoB100
              • 由4536个氨基酸残基构成，在肝细胞合成
            • 另一是ApoB48
              • 含2152个氨基酸残基，由小肠黏膜细胞合成
    • (2)rRNA转录后的加工修饰
      • 初级rRNA
        • rRNA的初级转录产物为45S rRNA，它是3种rRNA的前体
      • 
      • 加工修饰
        • 45SrRNA在核仁小RNA(snoRNA)、核仁小核糖核蛋白（snoRNP）介导下，经甲基化、剪切去除内含子等序列， 产生成熟的18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA
    • （3）tRNA转录后的加工修饰
      • 
      • ①5'-端和3’-端的加工修饰
        • 5'-端
          • 前体tRNA分子5’-端的16个核苷酸前导序列，由核糖核酸酶P（RNase P)切除。
          • RNase P属于核酶，是具有催化功能的RNA
        • 3'-端
          • A、氨基酸臂的3'-端2个U，被核糖核酸内切酶RNase Z切除
          • B、有时核糖核酸外切酶RNase D，也参与切除过程
            • 八版前认为UU是D切除掉的
          • C、氨基酸臂的3'-端由核苷酸转移酶加上特有的CCA末端
      • ②茎-环结构的碱基修饰、切除内含子
        • 稀有碱基
          • 茎-环结构中的一些核苷酸碱基经化学修饰为稀有碱基
          • 
        • 切除内含子
          • 剪接切除茎-环结构中部14个核苷酸的内含子，由tRNA剪接内切酶、tRNA连接酶催化完成
  • 4、原核生物与真核生物RNA转录的比较
    • 
    • 单顺反子编码一个基因片段；多顺反子编码多个多肽链。
    • 单顺反子只含有一个翻译起始点和一个终止点；多顺反子对应于同一转录单位内，但各自拥有起点和终点。
  • 5、核酶ribozyme
    • 有催化作用的RNA，称为核酶
      • 核酸酶是能水解核酸的蛋白酶
    • 意义
      • ①核酶的发现，对中心法则作了重要的补充，是继逆转录现象之后，对RNA重要功能的另一阐明
      • ②核酶的发现又是对传统酶学的挑战，因为传统酶学认为酶是蛋白质