细胞周期检测

包括原理、步骤、注意事项，细胞周期检测是生物学研究中一项重要的实验技术，用于分析细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的全过程。细胞周期主要分为G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（细胞分裂期）。

细胞周期检测

• 原理
  • 细胞周期
    • 细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束为止的活动过程
    • G0期：休眠细胞，细胞暂时脱离分裂周期，不进行DNA复制和分裂；在某些条件诱导下可重新开始DNA合成，进行细胞分裂
    • G1期：主要合成RNA、核糖体、蛋白质、脂类和碳水化合物
    • S期：主要合成DNA，还会合成组蛋白、DNA复制所需要的酶
    • G2期：DNA合成后期，主要大量合成ATP、RNA、蛋白质，包括微丝微管蛋白
    • M期：RNA合成停止，蛋白质合成减少，染色体高度螺旋化
  • 检测原理
    • PI（碘化丙啶），一种DNA双链染料 可与双链DNA结合，产生荧光，荧光强度与双链DNA含量成正比；被染色后，可用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，根据DNA含量分布情况，得出各个时期细胞百分比数，进行细胞周期和细胞凋亡分析。
    • G0/G1期——二倍体细胞的DNA含量（2N）
    • G2/M期——四倍体细胞的DNA含量（4N）
    • S期——介于2N和4N之间
• 步骤
  • 收集细胞：: 收集细胞5~20×105于离心管中，若细胞比较小(如淋巴细胞)400 g离心，若细胞比较大(如肿瘤细胞)300 g离心，5~10 min，弃去培养液。
  • 洗涤：加入1 ml冷PBS(提前放4℃预冷)洗涤1次，离心弃去上清
  • 固定前处理：利用管底残留的液体，轻弹管底，将沉淀重悬成细胞悬液，避免细胞成团
  • 细胞固定：加入约1 ml -20℃预冷的无水乙醇中，轻轻吹打混匀，-20℃固定1 h或过夜
  • 洗涤：加入1 ml冷PBS(提前放4℃预冷)洗涤1次，300 g离心10min，弃去上清
  • RNA酶消化：300 g 离心 5 min，吸尽上清后，加入 100 μL 的 RNase A 并充分悬浮细胞，37°C 水浴 30 min
  • PI染色：加入400μL的PI溶液并充分混匀，4℃避光孵育30 min
  • 上机检测：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，低速获取细胞，采用分析软件进行DNA含量分析
• 注意事项
  • 1、培养细胞注意无菌环境。
  • 2、染液等物质有一定毒性，注意防护。
  • 3、本实验上机检测所需收集细胞量较多，收集细胞时尽量多收集一些。
  • 4、本实验对细胞离心，重悬次数较多，注意动作轻缓，避免过多地损伤细胞。
  • 5、固定时必须预冷PBS重悬打入无水乙醇中，二者顺序不可颠倒。
  • 6、培养细胞时，以对数期处理为宜，避免细胞量过少导致收集细胞量不足或者细胞量过多导致细胞开始大量死亡造成的实验误差。
  • 7、固定后细胞虽然可以保存较长时间后再上机检测，为避免不可控因素影响最好及早上机检测。