流式细胞术

包括原理、步骤、应用，流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种基于单细胞水平、多参数分析分选的强大工具，在生物学、医学和药学等多个领域具有广泛的应用。以下是对流式细胞术的详细介绍，希望对大家有所帮助！

流式细胞术

• 原理
  • 用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析
• 步骤
  • 样本类型：外周血、骨髓、细胞穿刺液、实体组织、培养细胞、微生物、藻类
  • 准备单细胞悬液
    • 悬浮细胞样本：离心重悬
    • 贴壁细胞样本：消化后离心重悬
    • 免疫器官样本：研磨，收集单细胞悬液后，裂解红细胞，离心去除红细胞碎片后，PBS重悬
    • 实体脏器样本：脏器剪碎后加入胶原酶、DNA酶等消化后，再进行研磨
  • 荧光染色
    • 表面染色：表面抗原分析
      • （1）0.5~1 x 106 细胞，洗涤重悬100 uL染色缓冲液中
      • （2）封闭（可选）：用Fc封闭或者抗体来源血清加入细胞悬液中4゜C孵育10分钟
      • 以减少非特异性结合
      • （3）染色：加入适当抗体，4゜C避光孵育10-30分钟
      • （4）洗涤重悬细胞于染色缓冲液中
      • （5）死活染色（可选）：上机前加入非透膜核酸染料，如PI，DAPI，7-AAD等。若细胞需要用1%多聚甲醛固定（包括固定破膜），则在(2)步前使用可固定的胺反应性死活染料（amine-reactive live/dead dye）
      • （6）上机检测
    • 胞内染色：胞内因子；核内抗原；胞内抗原
      • （1）死活染色（可选）：使用可固定的胺反应性死活染料
      • （2）表面抗原染色，洗涤
      • （3）固定：4%多聚甲醛，室温避光孵育15分钟
      • （4）透膜：洗涤后，用0.1%皂素室温孵育15分钟。或者用其他透膜剂孵育合适的时间。
      • （5）胞内染色：在含有透膜剂的染色缓冲液中，加入适量抗体， 4゜C避光孵育30-60分钟。
      • （6）洗涤重悬细胞于染色缓冲液中
      • （7）上机检测
  • 上机检测
    • 对照管
      • ①空白对照管：用于初步确定电压，检查自发荧光水平
      • ② 单阳管：多色实验中，用于计算补偿
      • ③ 同型对照管（选对物种、亚型）：评估抗体的非特异性结合（Fc受体或胞内蛋白结合），不建议用于区分阴阳群。
      • ④ FMO管（荧光素减去一）：区分阴阳性群
      • ⑤ 阳性对照管和阴性对照
    • 上机流程
      • 选择通道
        • 选择靠近荧光染料最大激发波长的激光作为激发光源
        • 选择靠近荧光染料最大发射波长滤光片作为接受通道
      • 电压
        • 基本原则：①分出目标细胞群；②位于线性检测范围
        • 实际操作中定电压（非最优电压）：
        • • 方法一：使用CS&T电压，同时确认最亮的阳性群信号仍在线性范围内（不超过 2 x 10^5）
        • • 方法二：阴性群的位置放在200左右（不适用于自发荧光较高的样本），同时确认最亮的阳性群信号仍在线性范围内（不超过 2 x10^5）
      • 阈值
        • 只有大于阈值的信号才能被记录下来
        • 目的：去除碎片及背景信号
        • 除非碎片太多或者检测<500nm的颗粒，否则一般使用默认值
      • 补偿
        • 可以在收取数据调节，也可以在分析数据时调节
  • 数据分析
    • FCS文件
    • 数据分析软件
      • 第三方软件:flowjo,cytobank,FCS Express等
      • 仪器相关的：FACSDiva(BD), CytExpert（Beckman）
    • 图形类型
      • 单参数直方图（histogram）
      • 双参数二维图
      • 散点图
      • 伪彩图
      • 等高线图
      • 密度图
      • 高维聚类降维生信分析
    • 圈门
      • （1）圈主细胞群，去除碎片
      • （2）去除粘连
      • （3）圈活细胞
      • （4）根据抗原圈细胞的相互关系
• 应用
  • 免疫分型
  • 细胞功能检测
    • 细胞凋亡
      • 正常细胞，磷酸酰丝氨酸（PS）位于细胞膜内侧；早期凋亡的细胞，翻转到细胞膜表面；膜联蛋白V（Annexin V）能与PS结合，从而标记早期凋亡的细胞
      • PI（碘化丙啶）不能透过正常细胞和早期凋亡细胞的完整细胞膜，可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜；将PI与Annexin V联合使用，活细胞——Annexin V-/pi-;早期凋亡细胞——Annexin V+/PI-;坏死细胞——Annexin V+/PI+
    • 细胞周期
      • (见上一篇笔记：细胞周期检测）
  • 可溶性蛋白(CBA)
    • 同样大小自带不同荧光（APC）强度的混合微球，表面包被有捕获抗体，可以捕获待测蛋白。与待测样本共同孵育后，加入带有另一荧光标记（PE）的检测抗体，形成“三明治”夹心复合物进行检测。CBA可以同时测量多种可溶性蛋白检测，是ELISA的替代检测方法