动物细胞的复苏、传代和冻存

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动物细胞的复苏、传代和冻存

• 细胞传代培养
  • 将培养1-2天后的HeLa细胞所在的培养皿放在倒置显微镜下观察，待细胞覆盖了培养皿底部80-90%的时候进行传代培养。
  • 在生物安全柜或超级工作台内，用移液器轻轻吸去培养液。
  • 用1ml PBS缓冲液洗底部2次(勿直接冲洗细胞层)。
  • 轻轻吸取PBS缓冲液后，向培养皿底部加0.5ml胰蛋白酶，轻轻倾斜培养皿，使其没过细胞层，室温消化3min。
  • 向培养皿中加入1ml 1640完全培养液终止消化，用移液器轻轻、反复吹打 细胞，使其悬浮。
  • 将悬浮液移入15ml离心管中，然后用1ml PBS缓冲液冲洗培养皿底部，清洗液一并加入离心管中，使总体积为 3ml(若不够，用PBS缓冲液补齐)。
  • 取1ml悬液加入装有5ml 1640RPMI完全培养液的新培养皿中。
  • 轻微晃匀以后放在CO2培养箱中培养（培养条件为37℃，5%CO2）。
• 细胞冻存
  • 离心
    • 将细胞传代培养步骤8中剩余的2ml悬浮液放在离心机中，室温离心1000rpm，5min。(如果直接来自培养中的细胞，需经过消化）
  • 分装
    • 离心结束后在超净工作台中弃去上清，细胞沉淀用1ml 1640冻存培养液悬浮(细胞浓度调到105-107/ml)，悬浮液分装到消毒的2ml细胞冻存管中，做好标记。
  • 冻存（慢冻）
    • 将冻存管放入细胞渐冻盒(程序性降温盒)中。
    • 在-80 ℃(超低温冰箱)冻存过夜。(通常以1-10 ℃ /min的速度降温为宜)
    • 将细胞取出放在液氮中长期保存。
    • 若没有细胞渐冻盒的情况下可以将细胞分别放在4 ℃两小时、-20℃两小时和-80 ℃两小时后，放入液氮中长期保存。
• 细胞复苏
  • 快融
    • 迅速从液氮中取出冷冻管，立即投入37℃水浴中，使细胞悬浮液融化(1min左右)。
  • 转移(无菌)
    • 酒精棉球擦拭冷冻管表面，在超净工作台用移液器吸出细胞悬浮液，加入装有5ml 1640RPMI完全培养液的细胞培养皿中。
  • 培养
    • 轻微晃匀以后放在C0,培养箱中培养(培养条件为37℃，5%CO2)
  • 换液
    • 培养24h，待大部分细胞贴壁后，更换一次培养液。