导图社区 临床标本处理与分离纯化技术
临床分子生物学检验之临床标本处理与分离纯化技术笔记，包括标本处理方法、样本分离纯化与质量鉴定两部分内容。
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第14章DNA的生物合成读书笔记
临床标本处理与分离纯化技术
标本处理方法
血液标本
全血标本
血清（浆）标本
肝素对TaqDNA聚合酶有强抑制作用，抗凝剂要避免
外周血单个核细胞
棉拭子、体液标本、痰液标本、组织标本、细胞标本
样本分离纯化与质量鉴定
策略
核酸分离4个步骤
制备细胞及破碎细胞
消化蛋白质，去除蛋白质，脂类等生物大分子
去除其他不需要的核酸分子
沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质
蛋白质一般流程
前处理
粗分离
细分离
DNA的分离纯化
条件
保证不含有对酶活性有有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子
最大程度避免蛋白质、多糖和脂类的污染
排除RNA分子的污染与干扰
基因组DNA的纯化
酚-氯仿抽提法
吸附柱法提取DNA
快速分离和纯化核酸，又克服苯对人体的危害
更适合临床检测中需要大量微量核酸分离纯化
步骤：细胞破碎-核酸特异性吸附在硅载体-洗脱
质粒DNA的分离纯化
碱裂解法
操作简单、重复性好且成本低，广泛使用
强碱-染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异来分离质粒
煮沸裂解法、SDS裂解法
线粒体DNA的分离纯化
血浆中游离DNA的分离纯化
RNA的分离纯化
比DNA的要求严格
大量RNAase可降解RNA，RNAase耐高温，不易失活
RNA是单链分子，很不稳定
总RNA的制备
mRNA的制备
mRNA分子最显著的结构特征是3'端的poly（A）尾
寡聚(dT）-纤维素层析或polyU琼脂糖柱的亲和层析法常用
循环miRNA的制备、长链非编码RNA的制备
蛋白质的分离纯化
蛋白质的性质和纯化原则
保证其生物学活性，避免样品反复冻融和剧烈搅动，
防止蛋白质变性
提取蛋白的常用方法
蛋白分子大小不同
透析、超滤、凝胶过滤和离心等
蛋白溶解度不同
pH值、离子强度、温度等影响
蛋白表面电荷不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
膜蛋白的分离纯化
外在膜蛋白
内在膜蛋白
核酸和蛋白的鉴定
核酸的鉴定
核酸含量测定
有共轭双键
紫外吸收光谱法（260nm波长）
纯度鉴定
核酸最大吸收峰在260nm/蛋白质最大吸收峰在280nm/盐和小分子的最大吸收峰在230nm
纯DNA的A260/A280值为1.8±0.1
若比值较高说明RNA污染；比值较低说明蛋白质污染
纯RNA的A260/A280值1.8~2.0
完整性检测
琼脂糖凝胶电泳，迁移率大小与核酸分子量成反比电泳后，需经过染色才能显示带型
蛋白质的鉴定
浓度测定
紫外吸收测定法（最简便）、Folin-酚试剂法（广泛，更灵敏）、考马斯亮蓝法、双缩脲法、荧光法
纯度测定
PAGE、SDS-PAGE、毛细管电泳、IEF、HPLC
