第四章 标记物及其与抗原抗体的结合物制备

第四章 标记物及其与抗原抗体的结合物制备，内容包含：标记免疫测定方法、标记物的种类及特性、常用的交联剂及特性、反射性核素与抗原抗体的结合物的制备、荧光素与抗原抗体的结合物制备、酶与抗原抗体的结合物制备.. ...

第四章 标记物及其与抗原抗体的结合物制备

• 标记免疫测定方法
  • 抗原抗体特异性结合反应（高特异性）
  • 标记物示踪检测（高灵敏性、高精密度）
• 标记物的种类及特性
  • 放射性核素（核医学）
  • 非放射性核素
    • 荧光物质
      • 基础知识
        • 荧光
          • 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁至激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量
          • 特点
            • 可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光
            • 一旦停止功能，荧光随之瞬间消失
        • 荧光光谱
          • 发射光谱
          • 激发光谱
        • 荧光效率
          • 由荧光色素本身的物理性质决定
          • 荧光物质将吸收的光能转化成荧光的百分率
        • 荧光寿命
          • 荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间
        • 荧光淬灭
          • 荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退
          • 例子
            • 紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯
          • 避免措施
            • 避免长时间照射
            • 脉冲瞬间照射
            • 避光保存
          • 淬灭剂
            • 具有荧光淬灭作用的物质
      • 荧光素
        • 常见
          • 异硫氰酸荧光素（FITC）
          • 四乙基罗丹明（RB200）
          • 四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）
          • 藻红蛋白（PE）
      • 稀土离子
      • 其他荧光物质
    • 酶与酶作用底物
      • 原理
        • 每种酶可与相应的显色或发光底物作用，产生典型的有色反应物或化学发光反应，通过反应的颜色或发光强度对被检物进行定性、定量分析
      • 常用的酶
        • 辣根过氧化物酶（HPR）
          • 应用范围最广
          • 组成
            • 糖蛋白（主酶）
              • 与活性无关
            • 亚铁血红素（辅基）
              • 酶的活性中心
          • RZ（纯读数）
            • 403nm（辅基）与275nm（主酶）的OD（吸光度）比值
            • 与酶活性无关
          • ELISA中应用最广
        • 碱性磷酸酶（ALP）
        • ß-半乳糖苷酶（ß-Gal）
      • 常用的酶作用底物
        • HLP的底物
          • • H2O2（受氢体） HRP对受氢体的专业性很高 DH2（供氢体、底物）
          • 常用
            • 邻苯二胺（OPD）
              • 最敏感，OPD 反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm，不稳定，致癌性
            • 四甲基联苯胺（TMB）
              • 最常用，反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色，测定波长450nm，稳定无致癌性， ELISA 中应用广泛的底物
            • 3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）
            • 对羟基苯乙酸（HPA）
              • 具有荧光底物性质，在H2O2存在下被 HRP 氧化成二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光
            • 5﹣氨基水杨酸（5- ASA）
            • 2,2'﹣氨基﹣二（3﹣乙基﹣苯并噻唑琳磺酸﹣6）铵盐 （ABTS）
        • ALP的底物
          • 常用
            • 对﹣硝基苯磷酸酯（ pNPP )
              • 经 ALP 作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm
            • 氯化硝基四氮唑蓝／5﹣溴﹣4﹣氯﹣3-哚-磷酸盐（ BCIP / NBT )
              • 常用于 ELISPOT 中的 PVDF 膜显色，在 ALP 的催化作用下， BCIP 被水解生成强反应性的产物; 该产物与NBT 发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色沉淀
            • 4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP）
              • 4- MUP 被 ALP 催化生成4﹣甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出450nm的荧光，可用荧光光度计进行测量
        • ß-Gal的底物
          • 常用
            • 4﹣甲基伞酮基- B - D 半乳糖（4- MUG ）
              • 作为底物，酶促反应后，产生高强度荧光物质4﹣甲基伞形酮（4- MU )
    • 化学发光剂
      • 直接化学发光剂
        • 特点
          • 化学发光反应简单，无需催化剂，背景噪声低
          • 极其稳定，有效期长达1年甚至更久
          • 化学结构上有产生发光的特有基团，发光过程快速，1秒内光子散射达高峰，整个过程在2秒内完成
        • 吖啶酯（AE）
          • 在碱性条件下与H2O2就可产生化学发光现象。在碱性介质中氧化时，这些化合物经历共价键的断裂，经过一个二氧酮的中间体，产生电激发的 N ﹣甲基吖啶酮，当它恢复到基态时，在470nm出释放出光子
        • 三联吡啶钌
          • 最常用
      • 酶促化学反应发光剂
        • 原理
          • 利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂
        • HRP ：鲁米诺及其衍生物
        • ALP : AMPPD
      • 电化学发光剂
        • 指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质
        • 特点
          • 反应在电极进行
          • 电子供体为：三丙胺（ TPA )
          • 化学发光剂：三联吡啶钌
    • 量子点（QDs）
      • 半导体纳米粒子，是指半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒（1-10nm)
      • 光学特性
        • 荧光强度高，稳定性好，抗漂白能力强
        • 具有"调色"功能，一元激发多元发射
        • 激发光波长宽，而发射光波长窄
      • 制备
        • 物理制备法
        • 化学合成法
          • 有机相体系
          • 水相体系
      • 表面修饰
        • 无机壳层修饰法
        • 化学修饰法
    • 胶体金/金溶胶
      • 金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液
      • 制备原理
        • 胶体金是氯金酸（ HAuClg ）在还原剂的作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液
        • 常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、维生素 C 、白磷、硼氢化钠等
        • 根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm~150nm不等的胶体金颗粒
      • 制备方法
        • 柠檬酸三钠还原法
• 常用的交联剂及特性
  • 均一的双功能交联剂
    • 碳二亚胺缩合法
    • 戊二醛法
    • 过碘酸盐氧化法
    • N-羟基琥珀亚酰胺活化法
  • 非均一的双功能交联剂
• 反射性核素与抗原抗体的结合物的制备
  • 基本方法
  • 纯化
  • 鉴定
  • 保存
• 荧光素与抗原抗体的结合物制备
  • 基本方法
    • 与蛋白质结合的化学反应基团
      • 酰基氨
        • 磺酸制备
      • 异硫氰酸
      • 重氮盐类
      • 胺制备
    • 原理
      • 利用抗体蛋白质的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫酸酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体
    • 搅拌法
      • 适用
        • 体积大、蛋白含量较多（＞40g/L）的抗体溶液
      • 优点
        • 标记时间短、荧光素用量少
      • 缺点
        • 非特异性荧光强
    • 透析法
      • 使用
        • 标记样品量少、蛋白质含量低的抗体溶液
      • 优点
        • 标记均匀、非特异性染色较低
  • 荧光素标记结合物的纯化
    • 去除未结合的游离荧光素
    • 透析法
      • 将标记的抗体放入透析袋中，不断更换透析液透析1周左右，直至透析液在紫外线灯照射下不发出荧光为止
      • 适用于：蛋白质含量低的标记物
    • 凝胶过滤法
      • 将标记的抗体通过 Sephadex G -25或 G -50凝胶柱，洗脱第一峰为荧光素标记抗体峰，第二峰为游离荧光素峰，收集第一峰即可
  • 荧光素标记结合物的鉴定
    • 荧光素与蛋白质的结合比率（F/P）
    • 抗原效价
      • 双向免疫扩散试验：效价＞1：16（理想）
    • 抗体特异性
      • 吸收试验
        • 向荧光抗体中加入过量对应抗原反应后，再用于阳性标本染色，应不出现明显荧光
      • 抑制试验
        • 阳性标本先与相应未标记抗体反应，洗涤后，再加荧光抗体染色，荧光强度应受到明显抑制
  • 保存
    • -20℃：1-2年
    • 真空干燥：长期保存
• 酶与抗原抗体的结合物制备
  • 方法
    • 一般是通过交联剂将酶与抗体或抗原相结合
    • 方法
      • 戊二醛法
      • 酶醛化法
      • 重氮化法
      • 碳二亚胺法
      • 混合酸酐法
      • 利用小分子上的活性部位与蛋白质上的氨基、羧基、酚基、硫基或羟基进行化学反应
  • 基本方法
    • 戊二醛交联法
      • 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与 HRP 和蛋白质分子中的氨基结合
      • 分类
        • 一步法
        • 二步法
        • 二步法效率更高
    • 改良过碘酸钠法
      • 最常用
      • 过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基，后者与抗体蛋白中的游离氨基结合形成 Schiff 碱，再加入硼氢化钠还原后，即生成稳定的酶标记物
  • 纯化
    • 目的
      • 除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物
      • 避免游离酶增加非特异显色
      • 避免游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度
    • 方法
      • 葡聚糖凝胶（ G -200/G-150）过柱层析法
      • 饱和硫酸铵沉淀提纯法
  • 鉴定
    • 方法
      • 免疫电泳
      • 双向扩散法
      • 出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有免疫活性 沉淀线经生理盐水反复漂洗后，滴加的底物溶液，若能在沉淀线上显色，则表示酶标记物中的酶仍具有活性
      • ELISA
        • 酶标记率测定常用分光光度计法分别测定酶标记物中酶和抗体（抗原）蛋白的含量，再用公式计算其标记率
  • 保存
    • 高浓度的结合物较为稳定
    • 冷冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右
    • 加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存
• 化学发光剂与抗原抗体的结合物制备
  • 基本方法
    • 直接偶联法
      • 通过偶联反应，使标记物分子中的发光集团直接连接到被标记物分子的反应基团上
    • 间接偶联法
      • 通过交联剂在标记物和被标记物之间插入一条链或一个基团，通过"桥"可以在原有结构中引进新的活性基团，增加反应活性，减弱偶联双方分子结构中存在的空间阻碍效应
  • 纯化
    • 透析法
    • 凝胶过滤法
    • 盐析沉淀法
  • 鉴定
    • 蛋白质的含量
    • 免疫学活性
    • 发光效率
  • 保存
    • 一般：分装保存，-70~4℃
    • 最好：冷冻干燥
• 稀土离子与抗原抗体的结合物制备
  • 基本方法
  • 纯化、鉴定、保存
• 量子点与抗原抗体的结合物制备
  • 基本方法
  • 纯化
  • 鉴定
  • 保存
• 胶体金与抗原抗体的结合物制备
  • 基本方法
    • 胶体金标记就是蛋白质等大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程
    • 机理是胶体金颗粒具有高电子高密度的特性，其表面的负电荷能与蛋白质的正电荷基团静电吸附而牢固结合
    • 这种结合过程主要是物理吸附作用，不影响被标记分子的生物活性
  • 纯化
    • 超速离心法
    • 凝胶过滤法
  • 鉴定
    • 电镜下测量颗粒的平均直径
    • 免疫组化滤纸模型鉴定特异性和敏感性
  • 保存
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