细胞培养的基础

培养细胞的特性、无菌技术、细胞的培养与传代、培养材料的选择与处理、细胞培养的类型和技术、细胞形态学检查、培养细胞污染的检测和排除、细胞的冻存和复苏

细胞培养的基础

• 培养细胞的特性
  • 培养细胞的生长方式及类型
    • 贴附生长型细胞
      • 上皮细胞型：其生长特点为细胞间紧密相靠，互相衔接，具有连接成片的生长能力。
      • 成纤维细胞型：其生长特点为细胞一般不紧靠相连成片，而是排列为漩涡状、放射状。
    • 悬浮生长型细胞
      • 不需要附着底物即可生长，肿瘤细胞及部分正常细胞
  • 培养细胞的生长特点
    • 贴附；接触抑制及密度依赖性；
  • 培养细胞的生长过程细胞系的生长
    • 单个细胞的生长过程
      • 细胞周期
    • 细胞系的生长过程
      • （1）原代培养 （2）传代期 （3）衰退期
    • 每代细胞的培养过程
      • 滞留期：一般细胞滞留期为24~96h
      • 指数生长期：此期细胞生长旺盛，成倍增长，适用于进行实验研究，持续3~5天。
      • 平台期：停止增殖
• 细胞培养实验室
  • 设施、设备
    • 空气净化系统；紫外灯；缓冲间, 操作间 清洗间；消毒间；储备间超净工作台、二氧化碳培养箱、相差倒、置显微镜、离心机、消毒设备、冰箱、水浴锅
• 无菌技术
  • 操作范围的消毒
    • 擦拭:工作台面,75%酒精/0.3%的苯扎溴铵等消毒液擦拭
    • 紫外照射:台面、操作空间，照射30-60分钟
  • 洗手和着装
    • 用超净工作台进行培养时，更换上培养室专用的工作服、拖鞋，戴口罩，清洗双手，75%酒精擦洗双手
  • 培养用品的清洗和消毒灭菌
    • 清洗
      • 玻璃器皿：A.浸泡 B.刷洗 C.洗液浸泡 D.冲洗；塑料器皿: 超声清洗紫外照射
    • 包装
      • 消毒前进行。牛皮纸，棉纱布；局部包装，全包装
    • 消毒灭菌
      • 干热消毒:玻璃器皿
      • 湿热消毒：高压灭菌，比干热消毒效率更高
      • 紫外线消毒：有限距离的台面
      • 过滤除菌消毒: 不能高温消毒的培养基、血清等
      • 消毒剂和抗生素
  • 无菌培养操作
    • 工作台面上的用品要合理摆放。原则上右手使用方便的用品放在右边，左手使用方便的放左边
    • 实验前点燃酒精灯，置超净台中央。一切操作都应在火焰近处并经过烧灼进行
    • 进行培养操作时，不要用手触及已消毒物品，如不慎接触，要用火焰烧灼或取备用品更换；面向操作野时勿大声讲话或咳嗽，以免把细菌等带入工作台面造成污染
    • 实验结束后及时清理台面，用适当的方法清除废弃物。擦拭干净后紫外照30分钟
• 培养材料的选择和处理
  • 胚胎和成体组织来源
    • 原代细胞培养常取自动物和人的胚胎组织
  • 正常和肿瘤组织来源
    • 正常组织：有的获得有限传代能力，1-3代，30-50代；有的可获得永生性，但保持二倍体、无致瘤性。
    • 肿瘤组织：实体瘤通常选择瘤体周围组织用于培养
    • 正常或肿瘤组织培养结果
      • A. 几次传代后死亡
      • B. 培养过程中发生转化、获得不死性，建立细胞株
      • C. 培养过程中经克隆筛选，建立肿瘤细胞株（对肿瘤细胞而言）
  • 取材方法
    • 基本要求：尽快培养、无菌操作、取材时要用锋利的器械如手术刀片切割组织，去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏死组织等、采用营养丰富的培养液
    • 基本器材和用品：1.眼科组织剪、弯镊、手术刀；2.装有培养液或Hanks液的小瓶；3.小烧杯（10ml, 50ml）；4.培养皿
  • 不同组织和不同部位的取材
    • 皮肤和粘膜的取材：a.术前皮肤消毒 b. 动物皮肤要先剃毛，碘酒、酒精消毒 c. 以获取上皮细胞为目的，则取皮不宜切取太厚；若要培养成纤维细胞，则相反.
    • 内脏和实体瘤的取材:内脏除消化道、呼吸道外基本无菌，但实体瘤向外破溃则可能感染, 尽量避开坏死液化部位；剔除组织间组织.
• 细胞培养类型及技术
  • 原代培养
    • 概念:是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养,实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养.
    • 原代培养组织或细胞的特点: a. 组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性； b. 原代培养细胞成分较复杂，离体后部分生物学特征尚不稳定，最好对细胞进行短期传代后再用于实验.
    • 常用原代培养方法：组织块培养和分散细胞培养
  • 传代培养
    • 定义：原代培养后的培养,细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代.
    • 传代培养基本步骤：
    • 培养细胞的传代
      • 一、组织块的传代：将原代培养物四周切去，留下植块中央部分加入新的培养液继续培养；将原代培养的组织块进行切割、分成若干份，重新种植进行培养。 二、贴壁细胞的传代培养： 消化、离心收集、稀释、换瓶 三、悬浮细胞的传代培养：离心收集、稀释、换瓶
  • 细胞系的培养与维持
    • 细胞系： 从来自于人或动物的肿瘤组织或正常组织的细胞，经长期选育而建立的传代细胞。包括有限传代的二倍体细胞和无限传代细胞系。
    • 细胞的传代与维持：换液、传代，冻存、复苏
    • 传代细胞特性
      • 持续繁殖特性；染色体组型为异倍体；如果正常细胞出现体内致瘤性，则表明已发生恶性转化。
• 细胞形态学检查
  • 倒置显微镜观察细胞形态和结构
    • 普通染色法观察：吉姆萨（Giemsa）染色法、 苏木精-伊红染色法（HE染色）
    • 特殊染色法观察： A.细胞糖类染色：PAS；B. 细胞脂类染色 ：苏丹红III染色；C. DNA显示：feulgen反应；D. DNA/RNA染色
  • 相差显微镜观察活细胞的生活特性
    • 细胞内各种结构间呈现清晰可见的明暗对比
  • 利用荧光显微镜观察细胞的形态和结构
    • 灵敏度高、可进行活体观察
  • 利用电子显微镜观察细胞的形态和细微结构
    • 扫描电镜（SEM）：形成三维结构图像，可显示细胞的表面结构，这是透射电镜不能做到的；标本制作简便、周期短，不需切片、染色。
• 培养细胞污染的检测和排除
  • 细胞污染
    • 概念：不仅仅指微生物，所有混入培养环境中危害细胞生存的成分和造成细胞不纯的异物均属于细胞污染。
    • 类型：包括生物污染：真菌、细菌、纳米细菌、支原体、病毒；化学物质污染：影响细胞生存、非细胞所需的化学成分；异种细胞污染：非同一种类的其它细胞污染。
  • 微生物的污染与检测
    • 真菌污染及检测
      • 烟曲霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌、孢子菌、白假丝酵母菌、酵母菌等
      • 培养基一般不变浑浊，较易发现，表面可见小点状漂浮物，白色/浅黄色；镜下可见菌丝。生长迅速，短期内造成细胞死亡
    • 细菌污染及检测
      • 常见的有大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等
      • 培养基明显变混，pH降低颜色变黄。镜下可见较均匀的点状颗粒移动。生长迅速，短期内大量繁殖，致细胞崩解死亡
    • 纳米细菌污染及检测
      • 对常规消毒灭菌法（90度高温）抵抗；对射线耐受；对抗素抵抗。
    • 支原体污染及检测
      • 在细胞污染中最常见
      • 支原体污染培养液一般不出现浑浊，细胞形态无明显变化，不易发现，但潜在影响很大，细胞生长缓慢
  • 细胞污染的预防和排除
    • 细胞污染的预防措施
      • 建立细胞库，消毒灭菌，针对操作等
    • 微生物污染的排除
      • a.抗生素排除法；b.加温除菌：支原体不耐热；41度5-10小时可以杀灭，但要考虑细胞的承受度；c.动物体内接种：同种动物腹腔/皮下
    • 避免细胞交叉污染
• 细胞的冻存、复苏和运输
  • 细胞的冻存的意义
    • 将细胞置低温保存，可使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存，在需要时再复苏细胞用于实验；
    • 减少耗费；对细胞进行早期的冻存，以尽量保存其原有的生物学特性；有利于细胞保种
    • 利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞；细胞贮存在液氮中，温度达-196OC，理论上储存的时间是无限的。
  • 细胞冻存和复苏的基本原则
    • 慢冻快融，最大限度地保存细胞活力
  • 细胞的复苏
    • 细胞复苏要求采用快速融化的方法