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第四章 红细胞检验技术
《临床血液学临床检验技术》第四章 红细胞检验技术知识点梳理，可用于检验医学职称老师复习。
编辑于2023-04-24 13:45:08 陕西- 可用于检验医学职称老师复习。
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第四章 红细胞检验技术
溶血的一般检验
红细胞寿命测定
【实验原理】
红细胞寿命测定(erythrocyte life span determination)是将标记放射性核素“Cr的红细胞注入血液循环后，逐日观察其消失率，记录成活曲线，以其在血液循环中消失1/2所需要时间（半衰期T1n)表示红细胞寿命。
【参考区间】
正常人红细胞51CrT1n为25～32天（核素标记法）。
【临床意义】
①溶血性贫血患者红细胞寿命缩短，T1n约为14天；
②再生障碍性贫血和脾功能亢进患者红细胞寿命缩短，T1n约为15~29天；
③真性红细胞增多症患者，红细胞寿命明显延长；
④缺铁性贫血患者，红细胞寿命多数正常，少数缩短。
【应用评价】
反映红细胞破坏最直接、最可靠的方法之一。
血浆游离血红蛋白测定
血浆中游离血红蛋白大部分与结合珠蛋白（haptoglobin，Hp)结合。若没有足够的Hp结合游离血红蛋白，就由肾脏来清除游离血红蛋白，导致血红蛋白尿。
【实验原理】
色原比色定量法的原理是：血红蛋白中亚铁血红素具有类过氧化物酶活性，在过氧化氢（H2O2)参与下，可催化无色的邻联甲苯胺脱氢而显蓝色，吸收峰在630nm，加入强酸(pH1.5）后呈黄色，吸收峰为435nm。根据颜色深浅，与同时测定的标准血红蛋白液对照，可求出血浆游离血红蛋白(plasma free hemoglobin)的含量。
【参考区间】
0～40mg/L（色原比色定量法）
【临床意义】
1.血浆游离血红蛋白增高是判断血管内溶血最直接的证据，严重的血管内溶血血浆游离血红蛋白常为60～650mg/L。
2.体外循环、心脏手术、血液透析、心脏瓣膜置换术后等所致的溶血，血浆游离血红蛋白可有不同程度增高。
3.血管外溶血、红细胞膜缺陷症血浆游离血红蛋白含量一般正常。
【应用评价】
溶血后立即取样，取样及分离血清应不避免溶血
血清结合珠蛋白测定
血清结合珠蛋白（haptoglobin，Hp)是一组由肝脏产生的a2糖蛋白，作用似血红蛋白的转运蛋白质。Hp能与游离血红蛋白结合形成稳定的复合物，其含量的变化与溶血直接相关。检测方法有电泳法、免疫法等，目前主要采用免疫比浊法（散射或透射比浊法）。
（一）醋酸纤维素膜电泳法
【实验原理】在待测血清中加入一定量的血红蛋白液，血清中的Hp即与血红蛋白形成血红蛋白-结合珠蛋白复合物（hemoglobin-haptoglobin，Hp-Hb复合物）。通过醋酸纤维素膜电泳法将结合的Hp-Hb复合物与未结合的Hp分开，测定Hp-Hb复合物含量，可得出血清中结合珠蛋白含量。
【参考区间】0.5～1.5g/LHb（醋酸纤维素膜电泳法）。
（二）免疫比浊法
【实验原理】在待测血清中加入一定量的抗血清Hp抗体，使之与待测血清中的Hp形成抗Hp-Hb免疫复合物，用比浊仪测量其散射光吸光度或透光度的变化，并与标准进行比较，计算出待测标本中血清Hp的含量。
【参考区间】0.16～2.0g/L（免疫比浊法）。
【临床意义】
1.严重血管内溶血时，Hp消失，电泳时，在其相应位置前面可出现一条区带，为高铁血红素白蛋白区带，此为血管内溶血所特有。
2.严重肝病、先天性无珠蛋白血症、传染性“单个核细胞”增多症等血清Hp也明显减低，此时不能根据该指标判断有无溶血。
3.血清Hp测定还可作为肝细胞性黄疸及阻塞性黄疸的鉴别指标之一，前者血清Hp含量减少，而后者常正常或增高。
4.血清Hp在感染、创伤、恶性肿瘤、类固醇治疗、妊娠等情况下可增高，此时Hp正常，不能排除合并溶血的可能。
【应用评价】
Hp为急性期蛋白，类似血清铁蛋白。
可反映溶血尤其是血管内溶血的情况，是反映溶血的较敏感指标
各种溶血性贫血(包括血管内和血管外溶血)，其含量均可减低甚至消失，减少程度常与病情的严重程度一致。
血清高铁血红蛋白测定
【实验原理】
【参考区间】阴性（分光光度法）。
【临床意义】可用于判断溶血严重程度，阳性提示严重血管内溶血。血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白明显增高，可检测出高铁血红素白蛋白。
【应用评价】只有在严重的血管内溶血时，血清中Hp和Hx均耗尽后，高铁血红素才与白蛋白结合形成高铁血红素白蛋白，故本试验是检测血管内溶血的重要指标，本试验阴性不能排除血管内溶血。出血性坏死性胰腺炎患者也可在580nm波长处观察到吸收区带，为假阳性。检测标本应避免外源性溶血，才能保证该检测的准确性。
尿含铁血红素试验
【实验原理】
尿Rous 试验，普鲁士蓝反应，血管内溶血时，血中游离血红蛋白增多，可通过肾小球滤过从尿中排出，形成血红蛋白尿。此过程中部分或全部血红蛋白被肾小管上皮细胞吸收分解，以含铁血黄素的形式沉积于细胞内，随细胞脱落从尿中排出。含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其中的Fe*离子在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，产生蓝色的亚铁氰化铁沉淀。
【参考区间】阴性
【临床意义】
本试验阳性提示有慢性血管内溶血，尿中有铁排出。临床上常见于PNH，阳性可持续数周。但在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，但肾小管上皮细胞尚未脱落，或上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素颗粒，本试验可呈阴性。
【应用评价】
Rous试验简便、快速，不需任何特殊仪器和设备，便于开展；对判断溶血部位，特别是对诊断慢性血管内溶血有重要意义。
铁代谢检验
血清铁测定
血清（浆）铁（serum iron,SI）是指血浆中与结姓蛋白（transferrin,Tf）结合的铁。可用分光光度法和原子吸收光谱法进行测定。
【实验原理】
分光光度法的原理是：SI以Fe*形式与Tf结合形成复合物，降低介质的pH及加入还原剂（如抗坏血酸、羟胺盐酸盐等），可使Fe+还原为Fe²+，与Tf的亲和力降低而从复合物中解离出来。解离出的Fe2+与显色剂（如菲咯嗪和2，2-联吡啶等)反应生成有色络合物，以铁标准液作对照，计算出血清铁的含量。
【参考区间】
成年男性11.6～31.3umol/L,女性9.0～30.4umol/L；均值为20umol/L,1岁后小儿时期约12μmol/L（分光光度法)。
【临床意义】
1.SI减低常见于生理性铁需要量增加(如婴幼儿、青少年和妊娠妇女）、缺铁性贫血、感染、恶性疾病、肾病综合征和慢性失血等。慢性失血是成人铁缺乏最常见的原因。
2.SI增高常见于肝脏疾病、铁粒幼细胞贫血、再生障碍性贫血、慢性溶血、巨幼细胞贫血、慢性酒精中毒和反复输血等。
【应用评价】
血清铁蛋白测定
检测方法
固相放射免疫分析法
化学发光免疫分析法
【参考区间】
【临床意义】
1.SF 降低
（1）体内贮存铁减少，如缺铁性贫血，是早期诊断缺铁性贫血的重要指标。
（2）失血、营养缺乏等，可作为孕妇、儿童铁营养状况调查的流行病学指标。
2.SF增高
（1）体内贮存铁增加，如原发性血色病、频繁输血。
（2）铁蛋白合成增加，如感染、恶性肿瘤等。
（3）组织内铁蛋白释放增加，如肝脏疾病等，可作为肝脏疾病如肝癌、病毒性肝炎、酒精性肝病等的辅助诊断指标。
【应用评价】
SF含量稳定，在排除肝脏疾病、感染、炎症、恶性肿瘤、妊娠等情况之外， 是判断体内铁贮存和铁营养状况最可靠、敏感的指标。
血清总铁结合力测定
血清总铁结合力(total iron binding capacity,TIBC)是指血清中转铁蛋白(transferring,Tf能与铁结合的总量，间接反映了循环血液中转铁蛋白的量。
【实验原理】
分光光度法的原理是：在血清中加入已知过量的铁标准液，使血清中全部的Tf与铁结合达到饱和状态，再加入吸附剂(轻质碳酸镁)除去多余的铁。按照SI测定方法，测得的血清铁含量，即为总铁结合力。总铁结合力减去血清铁，则为未饱和铁结合力(unsaturated iron binding capacity,UIBC)。SI占TIBC的百分比即为转铁蛋白饱和度(transferrin saturation, TS)。
【参考区间】
【临床意义】
1.TIBC增高
①缺铁性贫血和红细胞增多症等，因转铁蛋白合成增加、铁摄入不足或需要增加致；
②肝细胞坏死等贮存铁蛋白从单核-巨噬细胞系统释放入血；
③口服避孕药。
2.TIBC减低
子主题
①肝病、血色病，因贮存铁蛋白缺乏所致；
②肾病综合征、尿毒症，因转铁蛋白丢失所致；
③遗传性转铁蛋白缺乏症，因转铁蛋白合成不足所致；
④恶性肿瘤、慢性感染、溶血性贫血等。
【应用评价】TIBC结果较稳定，可反映机体Tf水平
血清转铁蛋白测定
血清转铁蛋白(serum transferrin,sTf)是一种能结合Fe3*的糖蛋白，主要由肝细胞和吞噬细胞合成，是体内最主要的铁转运蛋白
【实验原理】
免疫散射比浊法的检测原理是利用抗人转铁蛋白血清与待检测的Tf结 合形成抗原抗体复合物，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，可计算出Tf的含量。
【参考区间】
28.6～51.9umol/L（免疫散射比浊法）。
【临床意义】
1.sTf增高常见于缺铁性贫血和妊娠，也可见于口服避孕药、反复出血等。
2.sTf减低常见于遗传性转铁蛋白缺乏症、肝病综合征、肝硬化、急性白血病、恶性肿瘤、肾病综合征、溶血性贫血、某些炎症及恶病质等。
【应用评价】Tf是少数几种急性期反应减低的急性时相反应蛋白之一。
血清转铁蛋白受体测定
血清转铁蛋白受体（soluble transferring receptor,sTfR)是完整的细胞膜受体的一个可溶性片段，是由两个相同的85000Da亚单位构成的二硫键相连的二聚体。正常人约80%的TR被固定在幼红细胞膜上，sTfR是其游离形式，主要由幼红细胞在成熟过程中脱落而来。sTfR在调节细胞铁的摄取中发挥着关键的作用。它反映机体贮存铁以及所需铁的数量，是判断机体是否缺铁的一项敏感指标。可采用酶联免疫双抗体夹心法、放射免疫法和乳胶增强的免疫比浊法进行检测。
【实验原理】
酶联免疫双抗体夹心法的原理
【参考区间】
【临床意义】
1.sTfR增高常见于缺铁性贫血和溶血性贫血。在缺铁性贫血早期、溶血性贫血、红细胞增多症时sTfR浓度增加，且不受性别、年龄、妊娠、炎症、感染、肝病和其他慢性疾病的影响。一般建议sTfR>8mg/L作为缺铁性红细胞生成的诊断指标，对缺铁性贫血和慢性疾病所致贫血的鉴别诊断有价值。
2.sTfR减低常见于骨髓增生低下，如再生障碍性贫血、慢性病性贫血和肾衰竭等。
3.STR测定可用于观察骨髓增生状况和治疗反应，如肿瘤化疗后骨髓受抑制程度和恢复情况，骨髓移植后的骨髓重建情况，以及应用促红细胞生成素（EPO）治疗各类贫血过50
【应用评价】
叶酸、维生素B12测定
血清和红细胞叶酸测定
检测方法
放射免疫分析法
化学发光免疫分析法
【参考区间】
【临床意义】
叶酸减低有助于诊断由于叶酸缺乏引起的巨幼细胞贫血；
也可见于红细胞过度增生；
叶酸吸收障碍，如慢性腹泻、乳糜泻、小肠切除、服用抗癫痫药等；
叶酸利用增加的疾病，如溶血性贫血、骨髓增殖性疾病、甲状腺功能亢进、恶性肿瘤等。
血清维生素B12测定
检测方法
放射免疫分析法
化学发光免疫分析法
【参考区间】
【临床意义】
1.血清维生素B2减低 常见于巨幼细胞贫血、脊髓侧束变性及髓鞘障碍症等。血清维生素B12减低对巨幼细胞贫血诊断及病因分析有重要价值，维生素B12和叶酸在代谢上关系密切，临床上进行病因分析时常需同时测定维生素B12和叶酸。
2.血清维生素B12增高可见于白血病、真性红细胞增多症、某些恶性肿瘤和肝细胞损伤等。
【应用评价】
血清维生素B12吸收试验
【实验原理】放射核素
【参考区间】吸收正常者尿排泄的放射性活性为7%以上（核素标记法）。
【临床意义】巨幼细胞贫血<7%，恶性贫血<5%。若恶性贫血患者补充内因子后维生素B2重吸收得到恢复，表明维生素B12缺乏是由于内因子缺乏引起的，而不是肠道因素。
血清内因子阻断抗体测定
【实验原理】
血清内因子阻断抗体(intrinsic factor blocking antibody,IFBA)测定常用放射免疫法。维生素B12要与胃壁细胞分泌的内因子（IF)形成复合物后才能被吸收。内因子阻断抗体通过阻断IF与维生素B12的结合而影响维生素B12的吸收。用s7Co标记的维生素B2与血清中的IF结合，形成5Co维生素B2-IF复合物；当存在内因子抗体时，形成的复合物量减少。检测其放射活性，与阳性对照管进行比较，可得知内因子抗体的存在。
【参考区间】
健康人为阴性，比值≤1.00±0.10。比值≥阳性对照血清比值±0.10为阳性（放射免疫法）。
【临床意义】
内因子阻断抗体阳性：多见于由维生素B12缺乏引起的巨幼细胞贫血、恶性贫血等疾病。
本试验有助于查找维生素B12缺乏的原因。IFBA在恶性贫血患者血清中的检出率约为50%以上，可作为恶性贫血的筛查方法之一。
红细胞膜缺陷的检验
红细胞渗透脆性试验
【实验原理】
红细胞渗透脆性试验(erythrocyte osmotic fragility test)是检测红细胞对不同浓度低渗溶液抵抗力的试验。红细胞在低渗盐水中，水通过细胞膜内渗，使细胞膜膨胀破坏而溶血。实验室常使用开始溶血、完全溶血的盐水浓度衡量红细胞脆性，其脆性大小主要取决于红细胞表面积与体积的比值，比值越低，红细胞对低渗溶液的抵抗力越小(渗透脆性增加），反之，则抵抗力较高(渗透脆性降低）。
【参考区间】
开始溶血：3.8～4.6g/LNaC1溶液；完全溶血：2.8～3.2g/LNaC1溶液（简易半定量法)。
【临床意义】
1.增高 主要见于遗传性球形红细胞增多症（hereditary spherocytosis，HS）、遗传性椭圆形红细胞增多症（hereditary elliptocytosis，HE）、部分自身免疫性溶血性贫血、遗传性口型红细胞增多症及2型糖尿病等。
2.减低主要见于珠蛋白生成障碍性贫血，血红蛋白C、D、E病，低色素性贫血，以及阻塞性黄疸、脾切除术后、肝炎、肝硬化、肝癌等。某些中药（如当归）、磁场、紫外线亦可降低红细胞渗透脆性
【应用评价】
自身溶血性试验及其纠正试验
【实验原理】
自身溶血试验是测定患者血液在37℃孵育48小时后，自发产生溶血的程度。红细胞在孵育期间，由于膜异常引起Na+内流明显增加，ATP消耗过多，或由于糖酵解途径酶缺陷所引起ATP生成不足等原因，导致ATP储备量减少，钠泵功能减弱，Na*和水在细胞内蓄积，红细胞膨胀、破裂溶血。在孵育时，加入葡萄糖或ATP作为纠正物，观察溶血能否被纠正，为自身溶血试验的纠正试验(
【参考区间】
健康人红细胞在无菌条件下孵育48小时，不加纠正物的溶血率一般<4.0%，加葡萄糖的溶血率<0.6%，加ATP纠正物的溶血率<0.8%（分光光度法）。
【临床意义】
①遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加，能被葡萄糖或ATP纠正；
②葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏症等戊糖旁路代谢缺陷的患者自身溶血率增加，能被葡萄糖纠正；
③PK缺乏症时，不能利用葡萄糖产生ATP，其自身溶血率明显增加，不能被葡萄糖纠正，但能被ATP纠正；④获得性溶血性贫血如PNH、自身免疫性溶血性贫血及药物性溶血等加葡萄糖后效果不定，但是加ATP可明显纠正。
【应用评价】
本试验不够敏感和特异，仅对遗传性球形红细胞增多症有一定诊断价值，有助于溶血性贫血的鉴别诊断，但不能作为确诊试验。该试验的敏感性不如渗透脆性孵育试验，已趋向于淘汰。
酸化甘油溶血试验
【实验原理】
酸化甘油溶血试验(AGLT）的原理是：当甘油存在于氯化钠磷酸缓冲液的低渗溶液时，可阻止低渗溶液中的水快速进入红细胞内，减慢溶血过程。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质减少，促进红细胞溶血。检测时，吸光度随溶血的增加而下降。当红细胞膜蛋白或膜脂质有缺陷时，它们在pH6.85的甘油缓冲液中较正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度下降至起始吸光度一半时所需的时间（AGLTs）明显缩短。通常测定AGLTso反映红细胞膜是否有缺陷。
【参考区间】健康人AGLT50>290秒（分光光度法）。
【临床意义】
①缩短：遗传性球形红细胞增多症AGLT5可明显缩短（25~150秒），自身免疫性溶血性贫血、肾衰竭、妊娠等AGLTso也可缩短；
②HbH红细胞溶解明显减少，与缺铁性贫血不同，可作为初筛试验。
【应用评价】本试验对遗传性球形红细胞增多症诊断的敏感性和特异性较高。
高渗冷溶血试验
【实验原理】
高渗冷溶血试验（hyperosmotic cold hemolysis test）的原理是：在高渗状态下，温度骤然变化影响红细胞膜脂质的流动性，并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白结合位点，红细胞容易破裂而发生溶血。当膜蛋白缺陷致膜表面积与体积比值降低，溶血率明显增加；反之，溶血率降低。本试验是测定红细胞在不同浓度高渗缓冲液中，从37℃水浴立即置于0℃水浴一定时间的最大溶血率。
【参考区间】
9mmol/L或12mmol/L蔗糖：最大溶血率66.5%～74.1%；7mmol/L蔗糖：最大溶血率0.1％～16.9％（分光光度法）。
【临床意义】
增加见于遗传性球形红细胞增多症；降低见于珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病；自身免疫性溶血性贫血基本正常。
【应用评价】
本试验简便、易行，无需特殊试剂和仪器，是遗传性球形红细胞增多症的筛检试验之一。
红细胞膜蛋白电泳分析
【实验原理】
在4℃条件下，用低渗方法破坏红细胞，制备无细胞内容物的红细胞膜样品。将制备的红细胞膜样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE）,SDS与红细胞膜蛋白混合加热至100℃时,能使所有肽链之间的连接完全解离，同时肽链与SDS结合，形成SDS多肽复合物。以PAGE为载体，在电场作用下，膜蛋白能分离出各种区带。根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而求得各膜蛋白组分百分率。
【参考区间】
在4℃条件下，用低渗方法破坏红细胞，制备无细胞内容物的红细胞膜样品。将制备的红细胞膜样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE）,SDS与红细胞膜蛋白混合加热至100℃时,能使所有肽链之间的连接完全解离，同时肽链与SDS结合，形成SDS多肽复合物。以PAGE为载体，在电场作用下，膜蛋白能分离出各种区带。根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而求得各膜蛋白组分百分率。
【临床意义】
许多先天性和后天性溶血性贫血都伴有红细胞膜蛋白异常，可检出收缩蛋白等含量减低或结构异常。80%以上遗传性球形红细胞增多症患者有膜蛋白缺陷，包括膜收缩蛋白单独缺乏、锚蛋白与收缩蛋白联合缺乏、区带3蛋白缺乏、区带4.1、4.2蛋白缺乏等；遗传性椭圆形红细胞增多症患者可存在收缩蛋白或区带4.1蛋白缺陷；某些血红蛋白病和PNH等亦可有骨架蛋白明显异常；肝病也可有红细胞膜蛋白异常。
【应用评价】
本试验可直接反映红细胞膜蛋白的缺陷，有助于溶血性贫血病因分析，为红细胞膜缺陷性疾病诊断提供重要依据。
伊红——5——马来酰亚胺结合试验
[实验原理】
荧光染料红-5-马来酰亚（EMA)可以与红细胞膜带3蛋白第一个细胞外环上的Lys430形成共价键结合，在519nm吸收光，540nm放射光。带3蛋白结合了EMA后，其阴离子交换特性被部分抑制从而引起结构的改变。用EMA标记红细胞，采用流式细胞术可测定其平均通道荧光强度（mean channel fluorescence，MCF)。
【参考区间】
由于不同实验室报道的MCF参考区间存在显著差异，故每个实验室应确定自己的参考区间。往往一份待测标本需与六份正常标本进行比对（流式细胞术）。
【临床意义】
EMA结合试验可作为遗传性红细胞膜缺陷性疾病的筛查方法，可以将遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症与其他溶血性疾病进行鉴别(如G-6-PD缺乏症、血红蛋白病及自身免疫性溶血性贫血），前者MCF值明显低于正常人（为正常人的65%左右）及其他溶血性疾病。
【应用评价】
该法目前被认为是快速筛查遗传性红细胞膜缺陷性溶血性贫血尤其是遗传性球形红细胞增多症的方法。
红细胞膜蛋白基因检测
[实验原理】
采用限制性片段长度多态性(RFLP)或串联重复序列分析可确定遗传性红细胞膜缺陷和某个基因的相关性，用单链构象多态性分析、聚合酶链反应(PCR)结合核苷酸测序等可以测定出膜蛋白基因的突变位点。
【临床意义】
遗传性球形红细胞增多症患者大多属显性遗传，少部分为隐性遗传，可归属于基因突变，突变的位置多在CpG二核苷酸，造成该部位小的缺失或插入。HE患者膜蛋白基因突变主要包括膜收缩蛋白、4.1蛋白、带3蛋白等，突变多为单碱基置换，少数为其他突变或缺失。
【应用评价】
该方法可用于诊断遗传性球形红细胞增多症。鉴于各种原因，目前临床上此项目尚未能普及。
红细胞酶缺陷的检验
G-6-PD荧光斑点试验和活性测定
试验原理
340nm
参考区间
荧光斑点法
活性测定Zinkham法
临床意义
】G-6-PD活性下降或缺乏见于蚕豆病、服用某些药物（如伯氨喹、磺胺药、抗疟药、砜类药）后引起的药物性溶血性贫血、感染等。利用此试验可对高发区域人群或疑诊的新生儿进行筛查。
【应用评价】
①荧光斑点试验具有特异性高、操作简单、标本用量少、检查时间短等优点，是较好的筛查试验，可用于筛查高发区域人群或疑诊的新生儿；
② Zinkham法可直接测定NADPH的量，对G-6-PD缺乏症诊断的特异性和敏感度均较高，但在溶血高峰期及恢复期，酶活性可以接近正常，故应离心去除衰老红细胞再进行测定，并于2~4个月后复查。在溶血发作期，接受红细胞输注也会影响酶活性测定结果。新生儿红细胞和网织红细胞内G-6-PD活性较高，应注意鉴别。
丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定
实验原理
NADH在340nm波长处有吸收峰，而NAD+没有，可通过测定340nm波长下吸光度，计算单位时间NADH减少量来求得PK活性
参考区间
荧光斑点试验：正常人荧光在25分钟内消失，中度缺乏（杂合子）时，荧光25~60分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光60分钟不消失。
活性测定：ICSH推荐Blume法 15.0U/g Hb±1.99U/g Hb。
【临床意义】
1.荧光斑点不消失或时间延长提示PK缺乏，是PK缺乏症的筛检试验。如疑为阳性，应做活性定量测定。
2.PK活性下降或缺乏，见于先天性PK缺乏症。严重缺乏（纯合子）时，PK活性为正常的25%以下；中间缺乏（杂合子）时，为正常的25%～50%。PK活性下降也可见于继发性PK缺乏症，如再生障碍性贫血、白血病、MDS等。
高铁血红蛋白还原试验
【实验原理】
高铁血红蛋白还原试验（methemoglobin reduction test，MHb-RT）是在待检血液中加入亚硝酸盐，使红细胞中的亚铁血红蛋白转变成高铁血红蛋白（MHb）。当红细胞内的G-6-PD正常时，可催化磷酸戊糖旁路代谢，生成足够的还原型辅酶Ⅱ（NADPH），其脱下的氢通过递氢体亚甲蓝和MHb还原酶的作用，使高铁血红蛋白还原成亚铁血红蛋白，溶液从暗褐色变为红色。当红细胞G-6-PD缺乏时，NADPH生成减少或缺乏，MHb不被还原或还原速度显著减慢。MHb呈褐色，在635nm波长处有吸收峰，通过比色法计算MHb还原率，可间接反映红细胞内G-6-PD的活性。
【参考区间】健康人高铁血红蛋白还原率≥75%(（脐带血≥77%）（比色法）。
【临床意义】
G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降，见于蚕豆病、服用某些药物（如伯氨喹、磺胺药、抗疟药、砜类药）后药物性溶血性贫血、感染等。G-6-PD中间缺乏（系合子型），外周血高铁血红蛋白还原率为31%～74%，脐血为41%～76%：G-6-PD严重缺乏（半合子或纯合子型），外周血高铁血红蛋白还原率常<30%，脐血<40%。
【应用评价】
本试验简便易行，对G-6-PD活性减低或缺乏检测具有较高的敏感度，是G-6-PD缺乏的筛查试验之一。
变性珠蛋白小体生成试验
【实验原理】
变性珠蛋白小体生成试验（Heinz body test)的原理是：由于G-6-PD缺乏导致NADPH和还原型谷胱甘肽（GSH)生成减少，当酶缺陷的红细胞接触氧化性物质后，血红蛋白所含巯基被氧化，生成变性血红蛋白或硫化血红蛋白，形成不溶性团块，附着于细胞膜上，亦称血红蛋白包涵体。在待检血样中加入乙酰苯肼，血红蛋白被乙酰苯肼氧化为MHb，经解离成高铁血红素和变性珠蛋白，后者聚合形成变性珠蛋白小体，附于红细胞膜上。用煌焦油蓝染色，油镜下观察并计算红细胞上含5个及以上珠蛋白小体的红细胞百分率。
【参考区间】健康人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞<30%（煌焦油蓝染色)。
【临床意义】
1.G-6-PD缺乏症阳性细胞常>45%，随病情好转，阳性细胞减少甚至消失。
2.不稳定血红蛋白病患者阳性细胞常>30%，还原型谷胱甘肽缺乏症也增高。
3.阳性细胞增高也可见于接触苯肼、硝基苯、苯胺等化学物质者。
【应用评价】变性珠蛋白小体生成试验是诊断G-6-PD缺乏症的筛检试验之一。
谷胱甘肽还原酶缺陷检测
[实验原理】
谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)催化反应体系中的NADPH转变为NADP*，NADPH在340nm波长处有吸收峰，测定340nm波长下吸光度的变化，通过计算单位时间生成的NADPH量来测定GR活性。
【参考区间】7.17U/gHb±1.09U/gHb（分光光度法）。
【临床意义】活性减低，见于先天性和获得性谷胱甘肽还原酶缺乏症。
【应用评价】本试验为红细胞GR活性测定的定量试验，特异性高，是诊断谷胱甘肽还原酶缺乏症直接和可靠的指标。
G-6-PD基因检测
【实验原理】
目前已将G-6-PD的cDNA成功克隆，可进行核苷酸序列分析。利用限制性内切酶可研究G-6-PD基因片段长度多态性；利用PCR可确诊基因的酶缺陷型，找出突变位点。
【临床意义】
世界范围内发现的G-6-PD基因变异型已超过160种，大多为编码区单个或多个碱基置换的错义突变，少数为缺失型。中国人群中共发现28种基因变异型，G1388A诊断或AG1376T和A95G为国人最常见的突变型。
免疫性溶血性贫血的检验
抗球蛋白试验
【实验原理】
抗球蛋白试验又称为Coombs试验，是检测不完全抗体的一种常用方法。自身免疫性溶血性贫血(患者体内产生抗自身红细胞的抗体(为IgG，不完全抗体)，能与表面有相应抗原的红细胞结合，使红细胞致敏，但不凝集。本试验分为检测红细胞表面有无不完全抗体的直接抗球蛋白试验和检测血清中有无不完全抗体的间接抗球蛋白试验。
直接试验应用抗球蛋白试剂[抗IgG、IgM、IgA和(或）抗C3]与红细胞表面的IgG分子结合，出现凝集反应，即为直接抗球蛋白试验阳性。
间接试验应用Rh(D）阳性O型红细胞与受检血清混合孵育，若血清中存在不完全抗体，可使红细胞致敏，再加入抗球蛋白血清，可出现凝集反应，即为间接抗球蛋白试验阳性。试验原理见图4-1。
【参考区间】正常人直接和间接抗球蛋白试验均为阴性。
【临床意义】
1.抗球蛋白试验是诊断AIHA的重要指标。自身免疫性溶血性贫血直接抗球蛋白试验阳性，当抗体与红细胞结合后，有过剩抗体时直接和间接试验均为阳性。AIHA多数属于温抗体型(即37℃条件下作用最强，主要为IgG型自身抗体)，但有少部分属于冷抗体(4℃条件下作用最强，主要为IgM型自身抗体)，故必要时应在4℃条件下进行试验，以排除假阴性AIHA主要以IgG型抗体为主，也存在IgG+C3型、C3型、IgG亚型（极少数）、IgA和IgM型，临床一般使用广谱的抗球蛋白血清进行试验。
2.冷凝集素综合征、阵发性冷性血红蛋白尿症、药物性免疫性溶血、新生儿同种免疫性溶血、溶血性输血反应、系统性红斑狼疮、传染性“单个核细胞”增多症、类风湿关节炎、淋巴细胞增殖性疾病、恶性肿瘤及某些慢性肝、肾疾病等直接抗球蛋白试验可呈阳性。
3.新生儿同种免疫溶血病直接和间接试验均呈强阳性，可持续数周，输血或换血数天后可变成阴性。由ABO血型不合引起的溶血，常为阴性或弱阳性
【应用评价】
本试验主要用于AIHA的诊断和分型诊断，直接试验最为常用，也更有诊断价值，它能敏感地测定吸附在红细胞膜上的不完全抗体和补体。间接试验主要用于Rh或ABO妊娠免疫性新生儿溶血病母体血清中不完全抗体的检测。脐血的直接试验阳性有助于新生儿溶血病的诊断。温抗体（IgG)型AIHA直接试验呈强阳性反应，间接试验多为阴性。
冷凝集素试验
【实验原理】
冷凝集素综合征患者的血清中存在冷凝集素，为IgM型完全抗体，其在低温时可使自身红细胞、O型红细胞或与受检者血型相同的红细胞发生凝集。凝集反应的高峰在0~4℃，当温度回升到37℃时凝集消失。
【参考区间】健康人血清中抗红细胞抗原的IgM冷集素效价<1：16（4℃）。
【临床意义】
阳性主要见于冷凝集素综合征患者。流行性感冒、支原体肺炎、传染性“单个核细胞”增多症、淋巴瘤、疟疾等可引起冷凝集素效价继发性增高。
【应用评价】
本试验方法简便、易于开展，是诊断冷凝集素综合征的主要依据。冷凝集素综合征患者本试验阳性，效价可达1：1000以上，病理性冷凝集素存在时一般于4℃滴度≤1:256。若反应温度在30℃时效价仍高，甚至高于4℃滴度，更有病理意义。阳性者抗体几乎均为IgM，但也有报告IgG或IgA增高。
冷热溶血试验
【实验原理】
冷热溶血试验的原理是：阵发性冷性血红蛋白尿症( PCH)患者血清中存在一种特殊的冷反应抗体即 Donath-Landsteiner 抗体（D-L抗体）。此抗体在20℃以下（常为0～4℃）时与红细胞结合，同时吸附补体，但不发生溶血。当温度升至37℃时，补体被激活，红细胞膜破坏而发生急性血管内溶血，故本试验又称为冷热溶血试验。
【参考区间】健康人为阴性（免疫法）。
【临床意义】
阳性主要见于阵发性冷性血红蛋白尿症患者。某些病毒感染如麻疹、流行性腮腺炎、水痘、传染性“单个核细胞”增多症等也可出现阳性反应。
【应用评价】
本试验是检测冷溶血抗体简易的过筛试验，对阵发性冷性血红蛋白尿症诊断有一定价值，患者D-L抗体效价可高于1:40。但若患者近期正处于溶血发作，由于补体已被消耗，可出现假阴性结果。
血红蛋白异常检验
抗碱血红蛋白测定
【实验原理】
抗碱血红蛋白（HbF）又称胎儿血红蛋白，具有比血红蛋白A(HbA)更强的抗碱作用。将待检的血红蛋白溶液中加入NaOH溶液后，HbA即发生变性沉淀，HbF抗碱能力强，没有变性而存在于上清液中。离心后取上清液于540nm处测定吸光度，可计算抗碱血红蛋白的百分含量。此试验也称为碱变性试验。
【参考区间】
正常情况下出生3个月后HbF比例迅速下降，2岁以上至健康成人一般在1.0%～3.1%，新生儿可达55%～85%。
【临床意义】
1.HbF绝对增多见于珠蛋白生成障碍性贫血，重型者达30%～90%，中间型常为5%~30%，轻型小于5%。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，HbF可高达100%。
2.HbF相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤、再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、卟啉病等。
3.HbF生理性增多常见于孕妇及新生儿。
【应用评价】本试验重复性较好，除HbF外，Hb Bar's和部分HbH也具有抗碱能力，需通过电泳鉴别。
HbF酸洗拖法检测
【实验原理】血红蛋白F酸洗脱法(hemoglobin F acid elution)检测的原理是：HbF具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力也比HbA强。将待检血涂片浸入pH3.3酸性缓冲液中37℃孵育一定时间，含HbF的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含HbA的红细胞均被酸洗脱，不被伊红着色。油镜下计数1000个红细胞，计算出着色红细胞（含HbF)百分率。
【参考区间】健康成人血涂片中含HbF红细胞<2%，新生儿可达55%~85%（酸洗脱法)。
【临床意义】珠蛋白生成障碍性贫血含HbF的着色细胞增加，重型患者大多数红细胞染成红色，轻型患者可见少数红细胞染成红色。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征全部红细胞均染为红色。再生障碍性贫血和其他溶血性贫血可出现少量着色的红细胞。
【应用评价】本试验简单易行，无需特殊试剂和仪器，适用于基层医院对HbF增高疾病的筛检，进一步确诊应进行血红蛋白电泳分析和基因检测。
红细胞包涵体试验
【实验原理】将氧化还原染料煌焦油蓝溶液与新鲜血液置37℃孵育一定时间后，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体，呈蓝色球形小体，均匀分布在红细胞内。油镜下观察并计算500个红细胞中含包涵体的红细胞百分率。
【参考区间】健康人含包涵体红细胞<1%（煌焦油蓝染色法）。
【临床意义】
1.HbH病患者孵育1小时就可出现包涵体，也叫HbH包涵体(hemoglobin H inclusion)，其阳性红细胞可达50%以上；轻型a珠蛋白生成障碍性贫血时，偶见HbH包涵体。
2.红细胞包涵体还见于不稳定血红蛋白病，不同型的不稳定血红蛋白需要的温育时间以及形成包涵体的形态、数量等各不相同，但孵育3小时后多数红细胞内可出现包涵体。
3.G-6-PD缺乏或细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。
【应用评价】本试验为检测不稳定血红蛋白的定性试验，只作为不稳定血红蛋白病和HbH病的筛检试验。
异丙醇沉淀试验
【实验原理】不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解。异丙醇为非极性溶剂，能降低血红蛋白分子内部氢键，使不稳定血红蛋白更快地裂解沉淀。在待检血红蛋白液中加入异丙醇于37℃作用一定时间，通过观察血红蛋白在异丙醇中的混浊或沉淀现象，对不稳定血红蛋白进行筛检。
【参考区间】阴性：30分钟内不出现沉淀。脐血为阳性结果，新生儿出生1个月后逐渐转阴，6个月后为阴性。
【临床意义】不稳定血红蛋白存在时，常于5分钟时出现混浊，20分钟开始出现绒毛状沉淀。血液中含有较多HbF、HbH、HbE时也可出现阳性结果。
【应用评价】本试验特异性较差，易出现假阳性，阳性结果只能说明存在不稳定血红蛋白，只作为不稳定血红蛋白的过筛试验。
血红蛋白电泳
醋酸纤维素膜电泳
等电聚焦法
尿素裂解法
聚丙烯酰胺凝胶法
毛细管电泳
高效液相色谱法
PCR技术检测血红蛋白基因
阵发性睡眠性红细胞血红蛋白尿症有关检验
酸化血清溶血试验
【实验原理】酸化血清溶血试验(acidified-serum hemolysis test)，也称Ham 试验，其原理是：PNH患者的红细胞由于膜有缺陷，对补体溶血效应的敏感性增加，这类红细胞在酸化（pH6.4~6.5)血清中孵育，可被激活的补体破坏，产生溶血。而正常红细胞不被破坏，无溶血现象。若血清经56℃加热30分钟，使补体灭活，患者红细胞即不被溶解。
【参考区间】健康人Ham试验阴性
【临床意义】
1.阳性主要见于PNH患者，是诊断PNH的重要依据。根据膜有缺陷的红细胞对补体的敏感性不同，可将PNH分为三型：I型，补体敏感型：强阳性：Ⅱ型，补体不甚敏感型：弱阳性；Ⅲ型，补体不敏感型：阴性。
2.某些自身免疫性溶血性贫血患者发作严重时可呈阳性反应，此时，如果将血清加热破坏补体后，试验结果由阳性转变为阴性，则更支持PNH的诊断。
3.球形红细胞在酸化血清内可呈假阳性反应，遗传性球形红细胞增多症者，在加热灭活补体后的血清中再做试验，仍呈阳性反应。
4.多次输血的PNH患者，因血中所含补体敏感红细胞的数量相对减少，试验可呈弱阳性或阴性反应，此时可延长保温时间（4~6小时），再观察有无溶血现象。
蛇毒子溶血试验
【实验原理】从蛇毒中提取的一种蛇毒因子可与备解素系统中的B因子结合，形成旁路途径的C3转化酶，激活血清中的补体C3，促使PNH患者补体敏感红细胞破坏、溶血。此即蛇毒因子溶血试验
【参考区间】溶血率＜5%，溶血率＞10%为阳性。
【临床意义】本试验的临床意义与Ham试验基本相同，一定程度上反映PNHⅢ型红细胞的溶血状况。
【应用评价】本试验为PNH的特异性试验，特异性比Ham试验高，PNHⅢ型红细胞对本试验敏感性最高，PNHIⅡ型次之，PNHI型不敏感。本试验的溶血度高低可大致说明PNHⅢ型红细胞所占的比例。
蔗糖溶血试验
【实验原理】蔗糖溶血试验（sucrose hemolysis test)的原理是：PNH患者的红细胞由于膜有缺陷，对补体溶血效应的敏感性增高。蔗糖溶液离子强度低，在含同型正常血清(含补体)条件下，经孵育后，可促进补体与红细胞膜结合，使对补体敏感的红细胞膜受补体攻击损伤形成小孔，蔗糖溶液进入红细胞内，导致渗透性溶血。而健康人红细胞则不发生溶血。
【参考区间】定性试验：健康人无溶血；定量试验：溶血率<5%。
【临床意义】
1.阳性常见于PNH。AA-PNH综合征患者亦可见阳性反应。
2.弱阳性反应或溶血率在1%～5%，可见于巨幼细胞贫血、冉生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、遗传性球形红细胞增多症等。
【应用评价】本试验敏感性高，可作为PNH的筛选试验，阴性可排除PNH。但其特异性不强，部分自身免疫性溶血性贫血患者可为阳性，白血病、骨髓硬化时可出现假阳性，故阳性者应再做Ham试验加以证实。
CD55和CD59检测
实验原理
流式
参考区间
根据CD59可以将PNH细胞分为三型：
①TYPEI型：CD59完全阳性正常细胞；
②TYPEⅢ型：CD59部分阳性补体中度敏感细胞；
③TYPEIⅢ型：CD59完全阴性补体敏感细胞。
以CD59（或CD55）阴性的红细胞>5%和CD59（或CD55）阴性的中性粒细胞>10%作为PNH诊断的临界值，非PNH患者和健康人均<5%；PNH患者CD59（或CD55）阴性的红细胞均>9%，多数患者>20%；CD59（或CD55）阴性的中性粒细胞均>16%
血细胞Flaer测定分析
【实验原理】嗜水气单胞菌毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多聚体，插入细胞膜脂质双层，在膜上形成孔洞致细胞溶破。PNH细胞缺乏GPI锚连蛋白而抵抗毒素，保持细胞完好。利用这一特性，采用荧光素(如Alexa-488)标记 aerolysin变异体（Flaer)，通过流式细胞术可以区分GPI阳性或阴性细胞。
【参考区间】Flaer在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上均有特异性表达，故健康人和非PNH患者Flaer程100%阳性
应用评价
卟啉病有关检验
红细胞內游离原卟啉检测
【实验原理】用乙酸乙酯和稀盐酸提取红细胞内原卟啉。红细胞内原卟啉为一荧光物质，在激发光450nm、发射光605nm处显示出原卟啉荧光光谱峰值，根据其荧光强度与标准品比较，可计算出红细胞内游离原卟啉（free erythrocyte protoporphyrin,FEP)含量。血红素由铁和原卟啉构成，当血红素生物合成途径的酶缺乏或由于铁缺乏导致血红蛋白合成减少时，原卟啉在红细胞中积累，此时FEP增高。
【参考区间】男性0.097～0.90μmol/L全血，女性0.144～0.90μmol/L全血（荧光法）；0.76umol/L红细胞±0.32umol/L红细胞（分光光度计法）。
【临床意义】
1.卟啉病患者FEP含量超过参考区间，多在5.4~81.0umol/L,是本病的主要诊断依据。
3.FEP增高还可见于铁粒幼细胞贫血、铅中毒、珠蛋白生成障碍性贫血和严重溶血性贫血等。
4.FEP减低见于恶性贫血、营养性巨幼细胞贫血和红白血病等。
2.缺铁性贫血 可见FEP含量增高，但很少会超过5.4umol/L。
【应用评价】本试验敏感性高，但特异性较差，故一般作为筛选试验。FEP可与锌离子络合成锌原卟啉(zinc protoporphyrin，ZPP)，临床上可选用ZPP检测仪检测ZPP，该法快速简便，数秒钟即可显示结果。
锌原卟啉试验
锌原卟啉(ZPP)又称原紫质，是血红素合成的中间代谢产物，是合成血红蛋白的重要物质。健康人体内游离原卟啉仅占总卟啉的10%左右，大部分以ZPP形式存在。故ZPP增多或减少与卟啉代谢过程中任何一种物质代谢障碍有关。
【实验原理】荧光光度法检测锌原卟啉的原理是：采用EDTA抗凝血，红细胞被洗涤后，用血液荧光计直接检测红细胞的荧光，检测用的激发光滤色片为415nm，发射光滤色片为595nm。测量前表面荧光，荧光度直接以umolZPP读出，血红蛋白可在分离反应混合物中测得，用umolZPP/mol血红蛋白表示。
【参考区间】19～38μmolZPP/mol血红蛋白（荧光光度法）。
【临床意义】ZPP增高可见于缺铁性贫血、慢性病性贫血、骨髓增生异常综合征、铅中毒、原发性卟啉病和白血病等；ZPP减低可见于某些良、恶性肿瘤等。
【应用评价】ZPP检测对铁蛋白水平低下或界限状态水平的人群（如妊娠中晚期妇女、低龄儿童、反复输血者）有价值。慢性病患者，如慢性感染性疾病、恶性肿瘤、慢性肝病和酒精中毒的患者建议同时检测铁蛋白和ZPP。
尿卟啉检测
【实验原理】尿卟啉(uroporphyrin)是卟啉中的一种。尿中卟啉类物质在酸性条件下，经乙醚提取，于405nm处显红色荧光，据此可对尿卟啉进行定性检测。
【参考区间】阴性（荧光法）。
【临床意义】阳性主要见于先大性红细胞生成性卟啉病、迟发性皮肤型卟啉病、肝红细胞生成型卟啉病等。
【应用评价】该试验简便、易行、快速，不需任何特殊仪器和设备，便于开展，是卟啉病简易的筛检试验。卟啉类化合物检测对研究血红素代谢障碍有重要意义，除卟啉病外，对缺铁性贫血、铅中毒、铁粒幼细胞贫血和珠蛋白生成障碍性贫血等的诊断有一定价值。