导图社区 蛋白质的分离与鉴定
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蛋白质的分离与鉴定
蛋白质相关性质
酸碱性质
在溶液中可以发生两性电离
胶体性质
19真题
直径
1-100nm
形成胶体原因
双电层
水化层
破坏胶体溶液
使蛋白质处于等电点pH
破坏水化层
沉淀反应
盐析法
原理
脱水剂法
试剂
丙酮、乙醇
重金属盐
重金属盐离子与负电基团反应
重金属盐离子
误服后
应服用牛奶或生蛋清
生蛋清本身是蛋白质,能够和重金属盐反应
生物碱试剂
生物碱试剂与正电基团反应
苦味酸、单宁酸、三氯乙酸
实例
柿石病(含大量单宁酸)
免疫化学性质
抗原
异源性
抗体(免疫球蛋白)(IgG)
呈Y字形
有2条重链,2条轻链
多肽链之间靠二硫键连接
重链和轻链的氨基末端在高级结构上相互靠近形成抗原结合位点
具有特异性,能识别并结合特异抗原
蛋白质分离纯化
要求
低温
需要缓冲液
蛋白酶抑制剂
含巯基试剂
根据溶解度差异分离
等电沉淀
pH=pI时,静电荷为0
粗分离
盐析与盐溶
盐析
概念
大量中性盐使蛋白质沉淀
大部分水用于水化盐离子
盐溶
低浓度中性盐,增加溶解度
形成双电层,吸附带相反电荷的盐离子
硫酸铵
09真题
二价离子
同样浓度时离子强度高
温度系数小
低温下仍可高浓度存在
溶解度大
对蛋白质活性影响小
利于分离
有机溶液沉淀
有机溶液
甲醇、乙醇、丙酮
高浓度下,可以使蛋白质沉淀
蛋白质变性沉淀
如加热可使一些蛋白质变性,理化性质改变而产生沉淀。
举例
三氯乙酸沉淀
酸性条件下,正电荷和负电荷结合形成不溶性沉淀
酶促反应
终止酶反应
使酶沉淀
根据分子大小差异
透析与超滤
透析
利用半透膜选择性除去某些小分子物质
超滤
使水溶液透过半透膜,蛋白质浓缩
密度梯度离心
根据离心力场中沉降速度不同
介质
蔗糖
密度梯度稳定
化学性质稳定
影响因素
质量
密度
形状
凝胶过滤层析(分子筛柱层析)
12真题
固定相中一定大小的网孔对不同成分阻滞程度不同
填料
交联葡聚糖
比凝胶孔径大(走的路程短)
先洗脱
比凝胶孔径小(走的路程长)
后洗脱
注意事项
柱床体积至少是上样体积的3倍以上
不能出现气泡和断层
柱床表面平整,并有一定水位
层析柱与水平面垂直
根据电荷差异
电泳
相关知识
带电粒子向与自身电荷相反的电极移动
分子质量
分子形状
电荷性质
分类
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶
优点
浓缩效应
样品经过浓缩胶浓缩后处于同一起跑线
分子筛效应
蛋白质分子越大,受到的阻力越大
电荷效应
带的电荷越多,迁移速度越快
等电聚焦电泳(IEF)
根据等电点不同
具有pH 梯度的凝胶介质
现象
蛋白质停留在等于其等电点的pH凝胶处
等电点低的靠近阳极(负极),等电点高的靠近阴极(正极)
作用
测定等电点
分离蛋白质
双向电泳
分辨率最高
一维方向上IEF
二维方向上SDS-PAGE
离子交换层析
静电引力强,疏水作用大,结合能力强
惰性固体支持物
亲水性强,形成较大网孔
纤维素,葡聚糖
可解离基团
阳离子交换剂
羧甲基纤维素
带羧基
阴离子交换剂
二乙基氨基乙基纤维素
带氨基
根据亲和力差异
亲和层析
10真题
根据与配基之间专一可逆结合
缓冲液洗涤
除杂
洗脱液洗脱
得到目标蛋白质
蛋白质鉴定
分子量鉴定
SDS-PAGE
15真题
特点
变性电泳,显示的是蛋白质亚基的质量
SDS
十二烷基硫酸钠(蛋白质变性剂)
SDS作用
消除蛋白质形状差异(呈长棒状)
使蛋白质带负电
步骤
1.标准品与未知蛋白质同时跑SDS-PAGE
2.标准蛋白质的迁移率与相对分子质量做标准曲线
3.测出未知样品分子量
凝胶过滤法
天然蛋白质分子质量
沉降速度法
沉降系数
每单位离心力场的沉降速度
免疫印迹分析(Western blot)
1.电泳
样品分离
2.转膜
将跑完电泳的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上
3.孵育
特异抗体,酶标二抗
4.显色
抗原抗体反应
用途
检测目标蛋白特异性
检测目标蛋白是否存在
测定目标蛋白相对分子质量与含量(结合标准蛋白)
定量分析
双缩脲反应
碱性溶液中与二价铜离子反应,生成蓝紫色络合物
注意
含有2个或2个以上的肽键
Folin-酚法
14真题
与双缩脲反应相比
双缩脲反应的基础上加入酚试剂,Tyr将酚试剂还原成蓝色化合物
在一定浓度范围内,光吸收值与蛋白质含量成正比
碱性条件下,与蛋白质反应生成蓝色物质
考马斯亮蓝法
17真题
次级键与碱性氨基酸相互作用,使最大光吸收从465nm转移到595nm
在一定浓度范围内,最大光吸收与蛋白质含量成正比
制作标准曲线
横坐标
不同浓度的牛血清蛋白含量
纵坐标
595nm光吸收
测定样品在595nm处光吸收值,与标准曲线对照
凯氏定氮法
蛋白质平均含氮量16%,乘以系数6.25即为蛋白质含量
缺点
所测的蛋白质含量偏高
紫外吸收法
11真题
郎伯比尔定律
公式
A=εbc
单位
ε
摩尔消光系数
b
比色标光径
cm
c
溶液浓度
mol/L
氨基酸
苯、酪、色
吸光度
近紫外区,280nm
由于大多数蛋白质有酪、色残基,所以可分析溶液中蛋白质含量
纯度鉴定
注意,本章主要以实验题为主,不懂得可以结合书本以及百度搜索!!!
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