导图社区 临床微生物检验第二章:真菌检验基本技术
导图分享考研知识之《临床微生物检验》真菌检验基本技术。真菌检查是通过直接镜检的方法,找到菌丝和孢子,以供初步诊断一种检查方法,希望对大家有帮助。
编辑于2019-05-06 16:13:02真菌检验基本技术
形态学检查
补充
检查方面 :致病性、传染性、传播途径、环境污染
1、真菌孢子可空气传播,操作应在生物安全柜进行
2、每天工作签应对工作区域进行消毒
3、不可直接闻培养基气味,以免孢子散播感染
4、不可对组织胞浆菌、球孢子菌玻片培养,因空气传播
一、标本采集注意事项
1、标本来源要适宜
2、要在用药前采集标本
3、采集标本要充足
4、采集过程中要严格无菌操作
5、采集后立即送检
二、直接镜检
标本制备
常用标本处理液
KOH
适用致密、不透明标本
生理盐水
观察真菌出芽现象
水合氯醛-苯酚-乳酸封固液
不透明标本检查
三、染色体镜检
1、革兰染色
各种真菌均为阳性?
2、乳酸酚棉蓝染色
适用:直接真菌直接镜检、培养涂片、小培养标本保存
3、墨汁复染
用于有荚膜的真菌、背景黑色,菌体不着色
4、荧光染色
通常有直接涂片、培养涂片、组织切片染色三种方法
5、瑞氏染色
染后油镜观察、常用于组织或骨髓中组织包浆菌等真菌检查
6、糖原染色
又称碘酸染色,用于直接涂片和组织病理切片染色检查
背景淡绿色,菌体红色
四、形态学检查意义
优点
1、有诊断意义:可以判断有些真菌种致病性
2、代表组织相:镜检看到真菌的形态就是该真菌的组织形态
局限性
1、灵敏度低:直接镜检不如培养敏感,可能会使假阴性
2、假阳性:溶解的淋巴细胞在脑脊液印度墨汁复染会被误认成新生隐球菌
非培养鉴定
免疫学检验
1、真菌感染的诊断,主要取决于病原学诊断
2、真菌产生抗体的速度慢、滴度低易引起严重反应
3、皮试实验
提取真菌抗原、进行皮内注射或斑贴实验,观察注射或实验部位有无红肿硬结
4、血清学
用乳胶凝集、酶联免疫、补体结合、荧光抗体及放射实验测定血清该抗体水平
分子生物学
1、DNA探针杂交、PCR及脉冲场凝胶电泳分析(PFGE)
2、常用检测片段:18SrRNA、P450、5SrRNA、gp43、26SITS
3、G实验
检测真菌细胞壁成分(1,3)-β-D-葡聚糖
4、GM实验
检测GM(半乳甘露聚糖),是由细胞壁表面释放的最早Ag
该实验是国际公认能作为侵袭性曲霉菌感染的早期依据诊断方法
培养鉴定
一、分离培养
工具
平皿、试管、培养箱、接种针、接种环和接种钩
培养基
营养要求不高,最适PH4~6。
不同培养基真菌菌落变化很大,一般用沙保罗培养基上的生长现象来描述菌落形态
二、培养方法
试管培养法
最常用、用于菌种传代接种。
使用方便、不易污染;但展示面积不够,不能完全显示菌落形态
大培养法
用培养皿或大型培养瓶装入培养基,接种标本
菌落大,易于观察;但接种易受污染
小培养法
微量培养法,是观察真菌结构及生长发育的有效方法
包括玻片培养、小型盖片培养、琼脂方块培养法等
三、生长现象(菌落)
1、生长速度
与菌落培养有关
快速生长(7-10d出现菌落)、慢速生长(3周内出现少许菌落)
2、菌落大小
与菌种、生长速度、培养环节、培养时间长短有关
3、菌落性质
酵母型、类酵母型、丝状菌落
丝状菌落可呈现棉絮状、绒毛状、或粉末状等形态)
4、菌落颜色
不同菌种有不同颜色、丝状菌落的表面和底层颜色不同
5、菌落边缘
有的整齐如刀、有的呈羽毛状
6、菌落底部
有的会陷入培养基、有甚至会使培养基开裂
四、抗真菌药物分类(作用部位)
1、细胞壁
普拉米星
2、细胞膜
两性霉素B、酮康唑
3、核酸(干扰DNA合成)
5-氟胞嘧啶
其他
大蒜新素
五、药敏试验
1
提供两种以上有相当活性的抗真菌药物的可信测量方法
2
检测体内活性、可预测治疗的效果
3
监测耐药性的发生
4
可预期研究新药的潜在治疗效能
六、抗真菌药物敏感试验
稀释法(定量)
MIC(可以观察到能抑制真菌生长的最低药物浓度,即最小抑菌浓度
主要采用肉汤稀释法、包括常、微量稀释法
实验步骤
1、试验前准备
培养基制备、药物原液配制、接种菌液制备、药物稀释
2、常用方法
常量稀释法、微量稀释法
3、结果观察
观察各管(孔)生长情况
4、质量控制
采用标准菌株作为每次测定质控菌株,其MIC应落在预期值范围里
制片扩散法(定性)
具体操作同“细菌药敏试验纸片扩散法”相似