考研生化 DNA的合成

临床医学考研--生化--DNA合成，其中心法则：*DNA复制、转录、逆转录：合成子链方向是5‘ → 3‘端。

DNA的合成

• 中心法则
  • *DNA复制、转录、逆转录：合成子链方向是5‘ → 3‘端
• 复制
  • 复制子
    • 原核：单复制子（一个复制起点）、多顺反子
    • 真核：多复制子（解决庞大的基因组复制问题）、单顺反子
      • *对比原核、真核的双向复制
        • 原核：单点起始（单复制子）
        • 真核：多点起始（多复制子）
  • 复制特点
    • 半保留
      • 母链两条链分别作为母链
    • 双向
      • 模板DNA形成两个延伸方向相反的复制叉
        • Y形头部：已解旋的两条模版单链 + 正在合成的子链
        • Y形尾部：还未解旋的模板双链
    • 半不连续：前导链、后随链（→冈崎片段）
    • 固定起始点
      • 大肠杆菌oriC（DNA上富含AT的序列）
    • 高保真性
      • 半保留复制（绝对保真）
        • 亲代DNA的5 → 3 / 3 → 5链均可作为复制模板
      • 复制叉的结构
      • 严格的碱基配对原则（A-T、C-G）
      • 修复系统：光复活、剪切、重组、SOS
      • DNApol
        • 正确选择碱基（对不同构型的糖苷键亲和力不同）
        • 3‘ →5‘核酸外切酶活性、校对功能
          • *总结：核酸酶
            • 水解DNA：DNase
            • 水解RNA：RNase
            • 水解两端磷酸二酯键：核酸外切酶（5 → 3 / 3 → 5）
            • 水解内部磷酸二酯键：核酸内切酶RE（普通、AP核酸内切酶、限制酶RE（特异、回文结构））
  • 复制体系
    • 原料（底物）：dNTP（N = A / G / C / T）
      • (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
        • *dNTP以dNMP的形式加入子链
    • 原核的DNApol：I、II、III
      • 均有3 → 5核酸外切酶活性：碱基错配修复（校正作用）
        • *仅DNApol I的小片段才有5→3核酸外切酶活性
          • 切除DNA引物（充当RNA酶）
          • 修复损伤
          • *连接冈崎片段
            • DNApol I
              • 水解RNA引物（充当RNA酶）
              • 聚合酶
            • DNA连接酶
      • 均有5 → 3聚合酶活性
        • DNApol I的Klenow（大片段）
          • 填补空隙（RNA引物被水解后留下的gap）（谁水解谁填空）
        • DNApol II
          • 应急低保真复制
        • DNApol III
          • 延长子链最主要（多亚基组成的异源二聚体）
          • • ① 2个核心酶
              • ：5 → 3聚合酶活性（复制中延长子链最重要）
              • ：3 → 5核酸外切酶活性（保证复制高保真性）
              • ：维系二聚体
            • ② 滑动夹（β亚基）：夹稳模板链，并能使酶沿模板链滑动
            • ③ γ-复合物
    • 拓扑异构酶
      • *参与DNA复制全过程
      • 解开超螺旋 → 松弛DNA链—避免DNA在解链时打结
      • 能水解 & 连接DNA单链 / 双链的磷酸二酯键
        • *总结磷酸二酯键
          • 生成
            • 拓扑异构酶
            • 引物酶（DnaG蛋白 / DNApol α）
            • DNApol
            • DNA连接酶
            • 端粒酶
            • 逆转录酶
            • RNApol
            • AC、GC
              • ATP →（AC）→cAMP
              • GTP →（GC）→cGMP
          • 水解
            • 核酸酶（DNase、RNase、外切酶、内切酶）
            • 部分核酶（RNA）
              • *核酸酶—蛋白质，核酶（ribozyme）—有催化作用的RNA
            • 部分DNA聚合酶（有核酸外切酶活性）
            • 部分逆转录酶（有RNase活性）
            • 拓扑异构酶
            • 磷酸二酯酶
        • 分型
          • I
            • 切掉DNA单链的一部分（→变松弛）不需ATP
            • 水解单链，又连接单链的磷酸二酯键
          • II（促旋酶）
            • 切断DNA双链，需ATP，将正超螺旋→负超螺旋
            • 水解双链，又连接双链的磷酸二酯键
    • 引物（合成）酶
      • DNA复制需要引物是因为：DNApol不具备催化2个游离dNTP形成磷酸二酯键的能力
      • 引物（短链RNA）：提供3-OH
      • 原核合成引物的引物酶：DnaG蛋白
        • *引物酶的本质：DDRP（以DNA为模板合成RNA的酶，属于RNA聚合酶）
  • 原核DNA复制过程
    • 起始
      • DnaA蛋白：辨认复制起点（eg.富含AT的序列）
        • 记忆：aim
      • 拓扑异构酶：解开超螺旋—松弛DNA链
      • DnaC蛋白：运送协助DnaB蛋白（解旋酶）解开双螺旋（双链 / 氢键）→ 形成2个延伸方向相反的复制叉
        • 记忆：break
        • 记忆：company
      • 单链DNA蛋白结合蛋白（SSB）：结合单链DNA—稳定模板的单链状态、保护（防止被核酸酶降解）
      • DnaB、DnaC、DnaG、oriC—引物酶（复制起点组成起始复合物 / 引发体）：合成引物（短链RNA）
        • 记忆：guide
        • *对比真核生物引物酶：DNApol α
    • 延长
      • 同一个DNApol III按5 → 3 以四种dNTP为原料，将dNMP加入引物 / 延长的子链
        • *回环复制：两条子链可在同一个DNApol III催化下延长
      • 前导链先进行、连续延长
      • 后随链后进行，不连续延长而形成冈崎片段
        • *对比真核生物
          • DNApol催化速率更慢
            • ① DNApol
              • 引物酶
            • ② DNApol
              • 应急、低保真复制、错配修复
              • 相当于原核的DNApol II
            • ③ DNApol
              • 线粒体DNA的复制
            • ④ DNApol
              • 延长后随链、错配修复
              • 起主要催化作用，相当于原核的DNApol III
            • ⑤ DNApol
              • 延长前导链、错配修复
          • 引物、冈崎片段更短
          • 需要PCNA（增殖细胞核抗原）复制
            • 使④、⑤获得持续合成的能力
            • 有夹稳模板链，使酶滑动的作用（类似原核DNApol III的β亚基）
            • 研究肿瘤
          • 有端粒
            • • 作用
                • 维持染色体稳定、保证DNA复制完整
              • 端粒DNA：真核染色体线性DNA的3‘末端，富含GT（G四联体）
              • 端粒酶（合成端粒）：RNA + 逆转录酶 + 协同蛋白
              • 合成端粒DNA
                • 爬行机制
                  • • 端粒酶辨认母链DNA的GT
                    • 端粒酶以自带的RNA为模板，经逆转录酶合成母链3‘端的GT
                    • 引物酶以母链新合成的端粒为模板合成引物RNA
                    • DNApol 延长子链
                    • 去除引物
          • 复制后组装核小体
            • DNA复制与核小体装配同步进行
          • 有mtDNA
            • D环复制
              • 复制起点不在同一位点：内外环复制有时序差
              • 酶：DNApol γ
    • 终止
      • 水解引物：DNApol I（小片段5 → 3核酸外切酶活性）
        • *对比真核生物切除引物：RNase、FEN1
      • 填补空隙：DNApol I（Kelnow 5 → 3 聚合酶活性）
      • 连接双链DNA中的单链缺口：DNA连接酶
        • 不能连接单独存在的单链，所以连接冈崎片段：DNApol I（充当RNase）、DNA连接酶
        • *总结DNA连接酶
          • 复制中最后连接双链DNA的单链缺口
          • DNA损伤修复
          • 连接目的基因与载体→重组DNA
• 逆转录病毒
  • 5 → 3
  • RNA → RNA / DNA → 单链DNA → 双链DNA
  • 逆转录酶：RDDP、DDDP、RNase H（无3→5核酸外切酶活性）
    • *总结逆转录酶
      • 基因重组工具酶之一：cDNA文库法合成目的基因（逆转录酶合成cDNA第一链）
      • 逆转录
      • 端粒酶是特殊的逆转录酶
  • 引物酶：病毒tRNA
    • *总结引物
      • DNA复制：引物RNA、引物酶DnaG蛋白（原核）、DNApol α（真核）合成引物
      • 逆转录酶：病毒tRNA
      • 转录：不需要引物
      • PCR：引物DNA