生物学-第二章 基因工程的工具酶思维导图

这是一篇关于生物学第二章 基因工程的工具酶思维导图，基因工程课程所设计涉及工具酶的性质就、特性等。

第二章　基因工程的工具酶

• 限制性核酸内切酶
  • 功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)
  • 限制修饰系统（细菌的防卫系统）
    • 限制作用：指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。
    • 修饰作用：生物细胞自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。
  • Ⅱ型限制性核苷酸内切酶
    • 基本特性
      • 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列
      • 大部分酶的切割位点在识别序列的内部或两侧
      • 识别切割序列呈经典的旋转对称型回文结构
      • 切割DNA均产生含5‘磷酸和3’羟基的末端
      • 错位切割产生粘末端，沿对称轴切割产生平末端
    • 酶解反应的操作
      • 大部分Ⅱ型酶所需相似的反应条件
      • 多酶联合酶解
        • 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但酶切位点不能有重叠
        • 对盐浓度要求不同的酶
          • 使用较贵的酶所需的盐浓度，加大便宜酶的用量 ，同时酶解
          • 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切
          • 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
  • 影响酶活性因素
    • 1||| DNA样品的纯度
      • 杂质：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaC等
      • 处理方法
        • 加大酶的用量：1μgDNA用10U酶
        • 加大反应总体积
        • 延长反应时间
    • 2||| DNA样品的甲基化程度：识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈一直限制酶的活性。
    • 3||| DNA的分子结构
      • 某些限制核苷酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性DNA的高出许多倍
      • 有些核酸限制内切酶切割不同位置的限制酶位点，其效率也有明显差别。
    • 4||| 核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即星活性（Star activity）现象。
    • 5||| 酶切反应的温度：大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是37℃
  • 限制性内切酶反应的终止
    • 大部分酶：65℃温浴5min
    • 一些具有热稳定性的酶（如BamH Ⅰ和HaeⅡ）：加入终止反应液（加入0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L以螯合Mg2+）
  • 应用
    • 在特异性位点上切割DNA，产生特异的限制酶切片段
    • 用限制酶切割产生相同的粘末端以便重组
    • 建立DNA的限制酶切图谱
    • 构建基因文库
    • Southern blotting
  • 消化DNA的步骤（0.2-1.0μgDNA的消化）
    • 加入合适体积的DNA溶液
    • 加入2μL适当的10×限制酶消化缓冲液，混匀
    • 加入1-2U限制酶，混匀
    • 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育
    • 加入0.5mol/L
• DNA聚合酶
  • 特性
  • 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(DNA pol Ⅰ)
    • 活性
      • 5'->3'的DNA聚合酶活性
      • 5'->3'的核酸外切酶活性
      • 3'->5'的核酸外切酶活性
    • 基本用途
      • 缺口平移(Nick translation)：5'->3'的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，是缺口向前推进。
      • 制备32P标记的DNA探针
  • 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow酶)
    • 基本性质
      • 来源：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理，获得其N端三分之一的大肽段，即为Klenow酶
      • 有5'->3'的DNA聚合酶活性 有3'->5'的核酸外切酶活性 丢失5'->3'的核酸外切酶活性
    • 基本用途
      • 1||| 补平由核酸内切酶产生的5'粘性末端
      • 2||| DNA片段的同位素末端标记
      • 3||| cDNA第二链发合成
      • 4||| 双脱氧链末端终止法测定DNA序列
  • T4-DNA聚合酶
    • 基本特性
      • ① 5'->3'的DNA聚合酶活性 ② 3'->5'的核酸外切聚合酶活性 ③ 缺乏5'->3'核酸外切酶活性 ④ 在无dNTP时，可以从任何3'-OH端外切 ⑤ 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 ⑥ 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
    • 基本用途
      • ①　切平由核酸内切酶产生的3'粘性末端
      • ②　DNA片段的同位素末端标记
  • T7噬菌体DNA聚合酶
    • 基本特性
      • ① 5'->3'的DNA聚合酶活性 ② 3'->5'核酸外切酶活性 ③ 已知DNA聚合酶中持续合成能力最强 ④ 改造后成为双脱氧链终止法对长片段DNA的测序酶
    • 基本用途
      • 用于较长DNA片段的引物延伸反应
      • 通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记
  • 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）
    • 基本特性
      • 来源：小牛胸腺
      • 不需要模板的DNA聚合酶，在３'-OH端随机掺入dTNP
    • 基本用途
      • 给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾巴
      • DNA片段3'末端的同位素标记
  • 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）
    • 基本特性
      • （1）由RNA指导的cDNA合成
      • （2）双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链（RNase H活性）
      • （3）DNA指导的DNA聚合活性
    • 常用的反转录酶
      • AMV：一种提取自纯化的禽成髓细胞瘤病毒的反转录酶（在42℃发挥作用）
      • MMLV:一种是Moloney鼠白血病病毒（MMLV）的反转录酶基因在大肠杆菌中的表达产物（在37℃发挥作用）
    • 基本用途
      • 将真核基因的没RNA转录成吃DNA，构建cDNA文库
      • 对具有5'突出端的DNA 片段的3'端进行不评和标记、制备探针
      • 代替Klenow片段，用于DNA序列测定
  • 耐热DNA聚合酶（Taq酶）
    • 热稳定性
    • 离子依赖性
    • 忠实性较差：具备5'->3'聚合酶活性和5'->3'外切酶活性; 但没有3'->5'矫正活性，会在合成的核算片段末端多加一个腺苷酸A
• 核酸修饰酶
  • T4－多聚核苷酸激酶（T4-PNK）
    • 特性：催化ATP的γ－磷酸基团转移至DNA或RNA5'-ＯＨ末端
    • 用途：用于探针末端同位素标记
  • 碱性磷酸单酯酶：去除DNA和RNA的5'端磷酸基
    • 作用：催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的５'-P末端转换成5'-OH末端，在分子克隆中的作用是防止粘性末端之间的自连
    • 基本用途
      • 去除载体 DNA的５＇端磷酸基团，防止载体自身环化，提高重组率
      • 去除DNA和RNA的5'磷酸基团，然后在T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记
    • 小牛胸腺碱性磷酸单酯酶（CIP）：68℃时失活
    • 大肠杆菌碱性磷酸单酯键（BAP）：68℃稳定，且耐酚抽提
  • 单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）
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  • 双链核酸外切酶
    • 核酸外切酶III（ExoIII）
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    • λ核酸外切酶（λExo）
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  • 单链核酸内切酶：S1核酸酶
    • 基本特性：来自米曲霉 ① 讲解单链DNA速度比讲解双链DNA快75000倍 ② 必需 Zn2+ ③ 最适oH范围：4.0~4.3 ④ 需要NaCl：10~300mmol/L
    • 基本反应
      • ①　内切单链DNA或RNA 
      • ②　内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA 
    • 重要用途
      • ① 去除DNA片段的单链突端，使之成为平端 ② 去除cDNA合成时形成的发夹结构 ③ 通过S1核酸酶保护实验，分析mRNA的量 ④ 成熟ｍRNA与基因组DNA杂交，结合此酶水解，可定位内含子 ⑤ 修整渐进性删除突变的末端
  • 单链内切双链外切核酸酶：Bal31核酸酶
    • 基本特性
• DNA连接酶
  • 常用酶
    • 大肠杆菌DNA连接酶：以NAD＋［烟酰胺腺嘌呤二核苷酸］作为辅助因子
    • T4噬菌体T4连接酶：以ATP［腺苷三磷酸］作为辅助因子
    • 作用机理相同
  • 基本性质
    • 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键
    • 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键
    • 连接平头双链DNA分子
  • 反应条件
    • 
  • 粘性末端的连接
  • 平头末端的连接
    • 直接用T4 DNA连接酶连接
    • 同居物加尾连接
    • 用衔接物连接
    • DNA接头连接