分子生物学技术

分子生物学方法大总结，包括了基因工程的方法和DNA and RNA 。分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。

分子生物学技术

• DNA基本操作技术
  • 植物DNA提取
    • 液氮研磨
      • 裂解液（CTAB）裂解
        • 苯酚和氯仿提取
          • 乙醇沉淀离心
            • 干燥溶解（超纯水和TE缓冲液）
              • 硅胶摸纯化柱）
  • 动物DNA提取
    • 磨碎
      • 裂解液（SDS）裂解
        • 苯酚和氯仿提取
          • 乙醇沉淀离心
            • 干燥溶解（超纯水和TE缓冲液）
              • 硅胶摸纯化柱）
  • 基因组DNA检测
    • 20—30kb
    • 带型单一无拖尾
    • A260=1约50ug/ml双链DNA A260/A280约1.8
  • 核酸凝胶电泳
    • 琼脂糖称样溶解加热（冷却60℃加溴化乙锭）
      • 制版倒胶
        • 取样（加载样缓冲液）点样
          • 电泳检测
    • 聚丙烯酰胺分辨率更高，（浓度约高分辨率也高）；
    • 脉冲电场凝胶电泳（分离超大分子质量）
  • 目的基因的获得
    • PCR
      • 变性
        • 退火
          • 链的延伸
  • DNA转化
    • 氯化钙转化法
      • 低温低浓氯化钙离心（原生质球）
        • 外源DNA复合物的吸附与42℃吸收
          • 培养（全培养基）
            • 选择培养基分离纯化
    • 热激动转化法
  • 核酸杂交（变形与复性）（DNA印迹杂交）
    • 核酸印迹转移
      • 电泳凝胶核酸印迹法
      • 斑点和狭缝印迹法
      • 菌落和噬菌体印迹法
    • 核酸印迹滤膜（尼龙，硝酸纤维素，二乙氨基乙基纤维素）与用于标记的探针杂交
    • 放射自显影
      • 碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离DNA
        • 电泳液移动转移胶质DNA
          • 固定胶中DNA
            • 预杂交和杂交（放射性和荧光检测C5和C3）
              • 结果检测分析
  • 双脱氧测序法（第一代核酸测序）
    • 制备DNA与引物退火
      • 四个反应系统方别加dNTP（dATP常同位素标记）和一种双脱氧核苷酸
        • DNA聚合酶或反转录酶定序反应
          • 产物变形后电泳和凝胶干燥
            • 放射自显影
  • DNA测序自动化
    • （增加了4种荧光染料红T黄G绿A蓝C）
  • 基因组DNA文库
    • 基因组DNA文库
    • cDNA文库（部分文库）
• RNA基本操作技术
  • 总RNA的提取
    • 异硫氰酸胍氯化铯超速离心法
    • 盐酸胍—有机溶剂法
    • 氯化锂—尿素法
    • 蛋白酶K—细胞质RNA提取提取法
    • 异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法
    • 常见的是T rizol
      • RNA纯品的OD260/OD280的比值为2，可根据比值估算RNA纯度
  • mRNA的纯化
    • DT亲和层析柱分离mRNA(利用polyA结构)
      • 洗涤低盐溶液和蒸馏水
    • 甲醛凝胶电泳 28S/18S为1.8～2.0 电泳带应在28在上，18在下，28S亮度为18S两倍
  • RNA纯度检测（OD260=1时相当于40ug/ml），纯品OD260/OD280=2
• 其他先进技术
  • 荧光定量PCR
    • 原理是DNA含量与扩增产物的对数成正比，荧光量与扩增产物量成正比，通过荧光量的检测就可以确定样本核酸量
    • 通过CT值和标准曲线对DNA的起始浓度进行定量
    • 可以动态监测反应过程中产物的量
    • 荧光探针
      • DNA Binding dyes（定量不够准确）
      • T apMan探针（定量较准确）
  • 酵母双杂交模型
    • 诱饵蛋白和猎物蛋白结合，便能形成荧光信号
    • 应用
      • 发现新蛋白和蛋白的新功能
      • 研究抗原和抗体的作用
      • 筛选药物的作用位点
      • 建立基因组组蛋白连锁图
  • RNA干涉技术
    • 通过转录后水平阻断基因表达，可为疾病治疗提供新途径
    • Si是导致基因沉默和特异性mRNA 降解的重要中央媒介
    • SiRNA的两条链的3’端各有两个碱基突出
    • ds蛋白加工使双链RNA30bp以上为21—25小分子核酸
  • 定点突变技术
    • 通过聚合酶链式反应（PCR）项目的定位片段中引入所需变化，包括碱基添加删除点突变等
    • 重叠引物PCR介导的定点突变是，在基因特定位点引入特定突变
    • 目的
      • 基因定点突变是按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入删除置换和重排等变异
      • 是研究蛋白质功能和结构关系的有利工具
      • 改造酶的不同活性或者动力学特征
    • 过程：设计引物，PCR扩增两端序列. 回收两端片段，两端片段退火延伸，测序验证A_变为G_C
  • RACE技术
    • 快速扩增已知mRNA末端的一段小序列或三'，五'的cDNA序列技术
• 基因工程
  • 限制性核酸内切酶
  • DNA连接酶
  • 酶
  • 提前目的基因的方法
    • 基因组文库分离
      • 缺点是工作量大，成功率低，需要大量测序
    • PCR技术克隆目的基因
      • 前提是对目的基因有一定了解，需要设计引物
    • 人工直接合成目的基因
      • 氨基酸序列到MRA核甘酸序列到DNA核甘酸序列
    • 逆转录法
      • 信史RNA模板，在逆转录酶的作用下，将脱氧核苷酸合成DNA
  • 导入受体细胞方法
    • 导入微生物细胞:转化转导转染
    • 导入植物细胞：农杆菌，基因枪法，花粉管通道法
    • 导入动物细胞：显微注射技术（显微镜下用显微注射仪直接导入）
  • 目的基因的筛选和表达
    • 原核生物：蓝白斑筛选（lac-Z基因表达产生半乳糖苷酶催化反应产生蓝色化合物）
    • 真核生物:通常直接观察性状变化
  • 应用
    • 创造新品种（抗虫棉花，蓝玫瑰培育，抗病毒甜椒，不引起过敏的大豆）
    • 医药生产：大肠杆菌或牛生产胰岛素生长激素干扰素，疫苗和免疫球蛋白
    • 提高观赏价值：产荧光鱼
    • 转基因动物作器官移植的供体
      • 小鼠长出人的耳朵
    • 疾病研究（猴子受精卵附加基因培育出小猴安迪，引进老年痴呆病基因，帕金森基因加快这些疾病疫苗的研发）
    • 基因诊断，（分析基因结构变异和表达状态，对疾病做出诊断方法和过程）
    • 基因治疗：将外源正常基因导入受体细胞以纠正和补偿基因缺陷和异常导致的疾病
  • 人类基因组计划
    • 任务
      • 序列图谱
      • 转录图谱
      • 物理图谱
      • 遗传图谱
    • 方法
      • 逐个克隆法
      • 全基因组鸟枪法
    • 序列组装原理
      • 直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆，然后依次向两侧连接的序列延伸