微生物保存方法二

微生物的菌种保藏，这一张讲述了液体石蜡保存法和植原体菌种保藏。液体石蜡法亦称矿物油保藏法,定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。

微生物保存方法二

• 液体石蜡保存法
  • 适用于不能分解液体石蜡的酵母菌、某些细菌(如芽孢杆菌属，醋酸杆菌属等)和某些丝状真菌(如青霉属，曲霉属等)
  • 此方法可阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，也可防止因培养基的水分蒸发而引起的菌体死亡，达到延长菌种保藏时间的目的。
  • 应选用优质化学纯液体石蜡。
    • 易燃
  • 保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充灭菌的液体石蜡。
  • 步骤
    • 将液体石蜡分装加棉塞，用牛皮纸包好，0.1MPa灭菌30分钟取出，置40℃恒温箱蒸发水分，经无菌检查后备用。
    • 斜面培养物的制备：斜面宜短，不超过试管三分之一为宜
    • 灌注石蜡：无菌条件下将灭菌的液体石蜡注入刚培养好的斜面培养物上，液面高出斜面顶部1厘米左右，使菌体与空气隔绝。
    • 将注入石蜡油的菌种斜面直立存放于低温(4℃-15℃)干燥处，保藏时间为2-10年不等。
    • 恢复培养 恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。
• 植原体菌种保藏
  • 指寄生于植物韧皮部和介体昆虫体内的、具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物。一般引起植物叶片黄化和发育畸形等症状。
  • 原理：这类微生物尚不能在人工培养基上离体培养，其细胞结构、与寄主植物的互作等方面也有其明显不同特点；培养植原体—植物共生体即是培养已感染植原体病菌的植物外植体。
  • 保藏方法：用组织培养法保藏感染植原体的植物组织，于5-25℃温度范围内保藏。
  • 方法
    • 培养基：1.选用适于植物组织正常生长的培养基，不含四环素簇抗生素或其它对植原体生长和繁殖有抑制作用的成分。
    • 培养温度和光照：20-28℃为宜；光照强度在1000-3000 lx，光期为10-14h/d。时间为1-3个月
    • 保藏温度和时间：常温保藏（20-28℃），保藏时间1-3个月。 低温保藏（6-10 ℃），保藏时间6个月至1年。
      • 注：保藏温度低于4℃会冻伤植物组织材料而导致植原体死亡。
  • 保藏指标
    • 当获得的组培苗表现典型症状或在荧光显微镜下观察到特异植原体DNA荧光后即可进行菌株的保藏。
  • 步骤
    • 外植体的采集：在田间采集表现典型症状的新鲜枝条，剪去叶和嫩稍，经酒精和升汞等消毒剂表面消毒后，截成具节茎段，移入培养基上培养。
    • 无杂菌组培苗的获得： 外植体长出新枝后，选无杂菌感染的外植体，截取新枝，移入新配制的培养基上培养和繁殖。如培养基被杂菌污染，将组培苗再进行表面消毒处理，移入新的培养基上培养，重复操作2-3次，直至获得无杂菌组培苗为止。
    • 组织带菌鉴定
      • DAPI荧光显微镜技术步骤：取植物幼茎、叶柄或根等，进行组织切片，厚度在100μm左右，用5％戊二醛固定2小时左右，用0.1M磷酸缓冲液（pH7.0）洗涤后，用1μg /ml 4’6－二眯基－2－苯基吲哚（DAPI）染色，最后置于落射荧光显微镜下检查韧皮部特异性植原体DNA荧光，激发滤光片波长为365nm,阻断滤光片波长为420nm。
      • PCR技术步骤：从组织中提取植物和植原体总DNA，用植原体16S rRNA等基因序列的引物进行PCR基因扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测特异性扩增产物谱带。
    • 常温保藏
      • 植原体-植物共生体在适宜的组织培养基上培养，并正常温度和光照下（20-28℃，光照强度在1000-3000 lx）进行保藏，保藏周期为1-3个月。
    • 低温保藏
      • 将正常温度和光照下（20-28℃，光照强度在1000-3000 lx）培养的植原体-植物共生体移入含组织培养基的试管内，移入6-10℃低温冷藏柜内保藏，1-2个月将试管暴露于正常培养温度和光照条件下补光2-3天，然后存放于低温冷藏柜继续保藏，保藏周期为6个月至1年以上。