大肠杆菌基因工程

《基因工程》主编夏启中，第十章大肠杆菌基因工程。基因工程菌，是指将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌。如大肠杆菌。基因工程的核心技术是DNA的重组技术。

大肠杆菌基因工程

• 大肠杆菌表达外源基因
  • 优势：①全基因组测序，共有4405个开放阅读框。②基因克隆表达系统成熟完善。③繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定。④被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。
  • 劣势：①缺乏对真核生物蛋白质的复性修复功能 ②缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 ③内源性蛋白酶降解空间构想不正确的异源蛋白 ④细胞周质内含有种类繁多的内毒素
• 大肠杆菌受体菌株及其相关表达载体
  • 受体菌株
    • DH5α菌株
      • 常用于质粒克隆的菌株。在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的 β－半乳糖苷酶氨基端实现 α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
      • 基因型为：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1
    • TOP10菌株
      • 基因型： F-，mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr)endA1，nupG
      • 该菌株适用于高效高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
    • J M109菌株
      • 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’
      • 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13噬菌体载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM109编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
    • BL21（DE3）菌株
      • 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）
      • 该菌株用于高效表达克隆于噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于 λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体。适合表达非毒性蛋白。
    • BL21（DE3）pLysS菌株
      • 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
      • 基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr
  • 表达载体
    • 融合型表达载体
      • pRSET载体（pREST-A、pREST-B、pREST-C）：携带有T7噬菌体启动子、RBS序列、ATG启始密码子、多克隆位点、大肠杆菌复制启始位点及氨苄青霉素抗性基因等结构元件。
      • pGEX载体（pGEX-1T、pGEX-2T、pGEX-3X）：Ptac 启动子、lac操纵基因、SD系列、Lac I阻遏蛋白基因等结构元件。
    • 非融合型表达载体
      • pKK223-3载体：具有强Ptac启动子（trp启动子的-35区、lac UV5启动子的-10区、操纵基因、SD序列等）
      • pET载体（pET-22、pET-28、pET-32等）：含有T7噬菌体启动子，可以整合在有T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌菌株BL21等菌株中受IPTG诱导剂诱导表达，在多克隆位点的N端和C端具有HIS标签，可通过镍柱对表达蛋白进行分离纯化。
    • 分泌型表达载体
      • PIN-ompA载体：含有复制起点(ori)、抗性筛选基因(AMPr)、调节基因lacI 、脂蛋白基因(Ipp)启动子、lacUV5 启动子及其操纵子基因(lacO)、SD序列、ATG起始密码子、大肠杆菌分泌蛋白（如外膜蛋白ompA）的信号胎序列基因、多克隆位点和HIS标签及终止子（含TAA终止密码）
• 基因工程菌的大规模培养与遗传不稳定性
  • 基因工程菌的大规模培养
    • 与普通微生物菌株相比，基因工程菌株的不同点：①由于质粒控制的外源表达，可能会对菌株的生长和分裂造成负面影响。②重组质粒容易发生丢失、重排和修饰，遗传不稳定。③发酵规模小，多小于10L。
    • 培养方式：分批培养、连续培养、分批补料培养、透析培养、固定化培养
  • 影响基因工程遗传不稳定性的因素
    • ①细胞分裂时重组质粒分配不均或核酸酶降解
    • ②重组质粒DNA的结构发生改变和表达功能丧失
    • ③重组菌长势低于非重组菌，宿主菌对重组质粒排斥
  • 改进基因工程菌遗传不稳定性的对策
    • ①改进受体系统，增强载体稳定性
    • ②培养基中加入抗生素，加大选择压力
    • ③使用营养缺陷型受体菌，质粒载体与受体互补
    • ④适宜的培养条件
• 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
  • 胰岛素的结构
    • 包括A、B两条链51个氨基酸（A链21，B链30）
  • 重组胰岛素大肠杆菌工程菌的构建
    • ①A链和B链分别表达法
    • ②A链和B链同时表达法
    • ③融合表达法
• 大肠杆菌中目的基因的高效表达策略
  • 包涵体型蛋白
    • 包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集聚在一起形成无膜包裹、裸露蛋白、水不溶性的结构。
    • 优点：①能简化外源基因表达产物的分离操作。②能在一定程度上保持表达产物的结构稳定。
    • 缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。
  • 融合型蛋白
    • 融合蛋白：外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放阅读框架进行表达。有这种咋和基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。
    • 目的蛋白的回收
      • 化学断裂法：用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr）。回收率高（可达到85%以上），专一性强。
      • 酶促裂解法：分为单残基位点和多残基位点。
  • 分泌型蛋白
    • 蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。目前用于分泌型蛋白表达的信号肽序列包括大肠杆菌的PhoA、LamB、OmpA、OmpF、OmpT的信号肽，金黄色葡萄球菌蛋白A的信号肽等。
  • 寡聚型蛋白
    • 通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡居串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略。
    • 优点：①目标蛋白高效表达。②稳定表达小分子短肽。
    • 缺点：目的产物回收困难。
  • 整合型蛋白
    • 同源序列依赖型的体内同源重组。