真核细胞DNA复制过程

这是一个关于真核细胞DNA复制过程思维导图，DNA的复制生命的遗传是染色体DNA自我复制的结果;• 染色体DNA的自我复制主要是通过半保留复制(Semi-conservative)来实现的，是一个以亲代DNA分子为模板合成子代DNA链的过程。

MB-03 DNA复制 #1

• 原核生物（大肠杆菌）复制的基本过程 • 复制的起始 (initiation) • DNA链的延伸 (elongation) • 复制的终止 (termination)
  • DNA链的延伸
    • DNA链的延伸需要的蛋白质: • DNA聚合酶 • 滑动夹（Sliding DNA clamp） • RNA酶(RNase H+exonuclease FEN1) 等) 在复制完成后切除RNA引物。 • DNA连接酶 (DNA ligase) 通过生成3’5’-磷酸二酯键连接两条DNA链。
      • DNA聚合酶
        • 原核生物DNA聚合酶的类型 大肠杆菌中主要有DNA聚合酶 I、II、III 、IV和V。
          • DNA Polymerase I
            • 5’ →3’核酸外切酶 它的5’ →3’核酸外切酶活性也可用来除去冈崎片段5'端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。
            • 3’ →5’核酸外切酶 它有 3’ →5’核酸外切酶活性，保证了DNA复制的准确性。
            • (coded by polA)不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，
          • DNA Polymerase III
            • DNA Polymerase III的聚合性 它的聚合活性较强，为DNA聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。
            • DNA Polymerase III的功能 • 它能在引物的3'-OH上以每分钟约5万个核苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。
              • DNA Polymerase III功能示意图
            • DNA Polymerase III的结构 • DNA聚合酶III (coded by polC)包含有7种不同的亚单位和9个亚基，其生物活性形式为二聚体。Core enzyme & holoenzyme
              • DNA Polymerase III结构示意图
          • DNA Polymerase II DNA聚合酶II (coded by polB)的活性很低，只有DNA聚合酶I的5%，所以也不是复制中主要的酶。生理功能主要是起修复DNA的作用。
          • DNA Polymerase IV& V • DNA聚合酶IV和V分别由dinB和umuD’2C基因编码，• 主要在SOS修复过程中发挥功能。
          • 在原核生物复制子中，下列哪种酶除去RNA 引发体并加入脱氧核糖核酸 。
        • DNA聚合酶的作用 DNA polymerase use a single active site to catalyze DNA synthesis DNA聚合酶利用单个活性位点催化DNA合成 DNA polymerase bound to a primer : template junction 与引物结合的DNA聚合酶：模板连接
          • palm domain: 1. Contains two catalytic sites, one for addition of dNTPs and one for removal of the mispaired dNTP. 2. The polymerization site binds to two metal ions that alter the chemical environment around the catalytic site and lead to the catalysis. 3. Monitors the accuracy of base-pairing for the most recently added nucleotides by forming extensive hydrogen bond contacts with minor groove of the newly synthesized DNA. 1包含两个催化位点， 一个用于添加dNTP， 另一个用于去除配对错误的dNTP。 2.聚合位点与两种金属离子结合，改变催化位点周围的化学环境并导致催化。 3.通过与新合成的DNA的小凹槽形成广泛的氢键接触来监测最近添加的核苷酸的碱基配对的准确性
            • 掌域的催化示意图
          • Finger domain: •Binds to the incoming dNTP, encloses the correct paired dNTP to the position for catalysis.•Bends the template to expose the only nucleotide at the template that ready for forming base pair with the incoming nucleotide. 1）与传入的dNTP结合，将正确配对的dNTP封装到催化位置。 2）弯曲模板，暴露模板上准备与输入核苷酸形成碱基对的唯一核苷酸。
        • DNA polymerase are processive enzymes • Processivity (持续合成能力，延伸能力) Processivity is a characteristic of enzymes that operate on polymeric substrates.• For DNA polymerase, the degree of processivity is defined as the average number of nucleotides added each time the enzyme binds a primer:template junction (a few ~50,000). 工艺性(持续合成能力，延伸能力) 加工性是在聚合物基质上操作的酶的特征。 •对于DNA聚合酶，加工程度定义为每次酶结合引物时添加的核苷酸的平均数量：模板连接（约50000个）。
          • DNA聚合酶以加工的方式合成DNA DNA polymerases synthesis DNA in a processive manner •Increased processivity is facilitated by the ability of DNA polymerase to slide along the DNA template .•Further increases in processivity are achieved through interactions between the DNA polymerase and a “sliding clamp” protein that completely encircles the DNA. •DNA聚合酶沿着DNA模板滑动的能力促进了加工性的提高。 •通过DNA聚合酶和完全包围DNA的“滑动夹”蛋白之间的相互作用，可以进一步提高加工能力。
        • DNA聚合酶的共同点 1、都以dNTP为底物。 2、都需要Mg2+激活。 3、聚合时必须有模板链和具有 3’-OH末端的引物链。 4、链的延伸都方向为5'→3'。
      • Sliding DNA clamps
        • Structure of a sliding DNA clamp
        • Sliding DNA clamps的作用 滑动DNA夹包围由相关DNA聚合酶产生的新复制的DNA。
      • Removal of RNA primers from newly synthesized DNA 😆 从新合成的DNA中去除RNA引物 RNase H removes all of the RNA primer except the ribonucleotide directly linked to the DNA end.An exonuclease removes the final ribonucleotide.DNA polymerase fills the gap, leaving a break in the backbone between the 3’OH and 5’ phosphate of the repaired strand.DNA ligase repairs this “nick”. 1）RNase H去除除直接连接到DNA末端的核糖核苷酸外的所有RNA引物。 2）核酸外切酶去除最后的核糖核苷酸。 3）DNA聚合酶填补了缺口，在修复链的3’OH和5’磷酸盐之间的主链上留下一个缺口。 4）DNA连接酶修复这个“缺口”。
        • 从新合成的DNA中去除RNA引物示意图
      • The composition of the DNA Pol III holoenzyme DNA Pol III全酶的组成 Three enzymes: • Two copies of the DNA Pol III core enzyme • One copy of the γ-complex
        • The composition of the DNA Pol III holoenzyme示意图
  • DNA复制的起始 • 复制起始原点 • DNA双螺旋的解旋 • 复制的引发
    • D N A 聚 合 酶 只 能 延 长 已 存 在 的 DNA链，而不能从头合成DNA链， 那么，新DNA的复制是怎样开始的 呢？ DNA polymerase requires a 3’-OH end to initiate replication DNA聚合酶需要3'-OH末端来启动复制
      • primer. The 3’–OH end is called a primer.
        • 引物详解与合成 A primer is a short sequence (often of RNA) that is paired with one strand of DNA and provides a free 3’ -OH end at which a DNA polymerase starts synthesis of a deoxyribonucleotide chain.The primase is a type of RNA polymerase (α) that synthesizes short segments of RNA that will be used as primers for DNA replication. 引物是一种短序列（通常是RNA）， 与一条DNA链配对，并提供一个游离的3'-OH末端， DNA聚合酶在该末端开始合成脱氧核糖核苷酸链。 伯氨酶是一种RNA聚合酶（α），它合成RNA的短片段，用作DNA复制的引物。
        • 也存在不需要引物的DNA聚合酶 在深海火山病毒中发现一种不需要引物的DNA聚合酶;
        • 引物作用示意图
    • ②单链DNA结合蛋白保持单链的存在
      • 单链DNA结合蛋白作用示意图
      • 机制 SSB与DNA的结合抑制分子内碱基对的形成。 Binding of SSB to DNA inhibits the formation of intramolecular base pairs.
    • 参与DNA复制起始和引发的蛋白质 • DNA解旋酶(DNA helicase) 催化DNA双链的解链过程。• 单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein)： 以四聚体形式存在于复制叉处，只保持单链的存在，并不能起解链作用。• DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 消除DNA双链的超螺旋堆积。• 引物酶(primase) 合成一小段RNA引物，为DNA新链的合成提供3’-OH末端。
      • DNA解旋酶(DNA helicase) 催化DNA双链的解链过程。
      • 引物酶(primase) 合成一小段RNA引物，为DNA新链的合成提供3’-OH末端。
    • 大肠杆菌基因组的复制原点 大肠杆菌基因组的复制原点位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操纵子之间，全长245 bp, 称为oriC。
    • ①解旋
      • DNA helicases separate the two strands of the double helix.
    • ③拓扑异构酶在复制叉处的作用 拓扑异构酶快速清除积聚在复制叉前的正超螺旋。 Topoisomerases在复制叉处的作用Topoisomerase rapidly remove the positive supercoils accumulate in front of the replication fork.
      • 拓扑异构酶作用示意图
  • 复制的终止 当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列(Ter)时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA
• DNA的复制 生命的遗传是染色体DNA自我复制的结果;• 染色体DNA的自我复制主要是通过半保留复制(Semi-conservative)来实现的，是一个以亲代DNA分子为模板合成子代DNA链的过程。
  • 复制机理
    • Bidirectional Replication (双向复制) 无论是原核生物还是真核生物，DNA复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的。• 复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。
      • 双向复制图示
      • 原核生物DNA的复制
        • 大肠杆菌DNA的θ结构 正处于复制之中
          • 处于复制过程中的θDNA
          • Cairns研究原核生物DNA复制，找到了双向复制的坚实 证据，其研究方法包括：
        • 原核生物DNA的复制特点 细菌染色体的复制是作为一个单位从唯一的复制起点开始，双向进行的。
          • 原核生物DNA的复制示意图❓
    • 半不连续复制模型(semi-discontinuous replication) . 为了解释DNA的等速复制现象,日本学者冈崎(Okazaki)等提出了DNA的半不连续复制模型(semi-discontinuous replication) .
      • DNA的半不连续复制 前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称之为DNA的半不连续复制
        • 半不连续复制示意图
        • Okazaki Fragments. The short discontinuous segments are called 冈崎片段
    • DNA的半保留复制 （semi-conservative replication） DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。
      • 图示
      • 实验 在仅以15NH4C1为氮源的培养基里，使大肠杆菌繁殖数代，将其DNA用重同位素15N标记上，然后立即将大肠杆菌转移到14NH4C1培养基中继续培养，按不同时间取样品抽提DNA，采用氯化铯密度梯度离心法分析
        • 实验预测示意图
    • DNA Synthesis的极性 由于DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此两个模板极性不同。• 所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’
      • DNA Synthesis 的极性示意图
  • 复制子 DNA的复制是由固定的起始点开始的。一般把生物体的复制单位称为复制子(replicon) ：指DNA复制时从一个DNA复制起点开始，最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。一个复制子只含一个复制起点。
    • 部分生物复制子的比较
    • 真核生物复制子特点 真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行复制，也就是说它们的基因组包含有多个复制子。
      • 真核生物复制子图示 ·DNA复制涉及到双螺旋的解绕。 ·DNA分子的解开看起来像一个向一个方向生长的“叉子”。 ·被复制的区域看起来像一个被称为“复制气泡”（红色）的气泡。
  • 复制叉 复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，复制起点呈叉子形式，被称为复制叉(Replication fork)。
    • 复制叉图示
    • 复制叉是不对称的
  • DNA 复制的体系 •亲代DNA分子为模板 •四种脱氧三磷酸核苷(dNTP)为底物 •提供3’-OH末端的引物 •多种酶及蛋白质 DNA拓扑异构酶、DNA解链酶、单链结合蛋白、引物酶、 DNA聚合酶、RNA酶以及DNA连接酶等
    • DNA 复制体系示意图
• 真核生物DNA的复制特点 • 有多处复制起始点；• 在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；• DNA复制只在S期进行。• 复制子相对较小，为40-100千碱基对。
  • 多处复制起始点示意图
    • DNA replication initiation in eukaryotes •This mechanism ensures that each origin of replication is activated only once per cell cycle. •An origin of replication can be used only if a prereplicative complex forms there in G1 phase. •At the beginning of S phase, specialized kinases phosphorylate Mcm and ORC, activating the former and inactivating the latter. •A new prereplicative complex cannot form at the origin until the cell progresses to the next G1 phase, when the bound ORC has been dephosphorylated. •As the forks begin to move, ORC is displaced, and new ORCs rapidly bind to the newly replicated origins. •这种机制确保每个复制源在每个细胞周期中只激活一次。 •只有在G1期形成复制前复合体时，才能使用复制起源。 •在S期开始时，特异性激酶磷酸化Mcm和ORC，激活前者并使后者失活。 •在细胞进入下一个G1期之前，当结合的ORC被去磷酸化时，新的复制前复合物不能在起点形成。 •当分叉开始移动时，ORC被移位，新的ORC迅速与新复制的起源结合。
    • Model for the progression of genome replication—domino model😆基因组复制进展的模型——多米诺骨牌模型 One replicon cluster (red) initiates replication at early S phase and DNA synthesis proceeds bidirectionally (replication bubbles). This activates initiation of neighboring replicon clusters (blue), which in turn activate replication at later replicon clusters (green) until the whole chromosome (see scheme below) is fully duplicated in G2 phase. 一个复制子簇（红色）在早期S期启动复制，DNA合成双向进行（复制气泡）。这激活了相邻复制子簇（蓝色）的启动，进而激活了随后复制子簇的复制（绿色），直到整个染色体（见下图）在G2期完全复制。
    • ARS 真核生物DNA的复制子起始点序列被称为ARS (autonomously replicating sequences)，长约150bp左右，包括数个复制起始必需的保守区。
    • ORC 真核生物DNA复制的起始需要起始点识别复合物（origin recognition complex，ORC）参与，ORC结合于ARS，它是由6种蛋白质组成的启动复合物。
• Key Terms
  • DNA的半不连续复制(semi-discontinuous replication)
  • DNA的半保留复制 (Semi-conservative replication)
  • DNA聚合酶(DNA polymerase)
  • 冈崎片断(Okazaki fragment);
  • 基因突变(DNA mutation)
  • 复制叉(Replication fork);
  • 复制子(Replicon);
• 真核细胞DNA复制过程 中DNA聚合酶的切换 (polymerase switching)示意图