导图社区 常见的实验问题和注意事项
涵盖了动物组织样本采集、原代细胞、流式细胞术、免疫组化、活体成像，结构清晰，内容全面，有助于实验人员了解各实验的要点和常见问题。
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常见的实验问题和注意事项
动物组织样本采集
鼻组织采集
做好灌流
鼻组织裂解液
确保低温环境
分装体积要根据自己实验来定
用于RT-qPCR
尽量剔除掉鼻组织上的骨组织
眼眶血
固定好头部
手要稳住毛细管，如果无法稳住或者毛细管快脱落，可将另一端毛细管抵住离心管内壁，然后手指轻微调节方向
CLN
单侧：甲状腺上3-4个，腮腺旁1个，颈深1-2个
破皮的时候不要剪的太狠，拎起一小部分皮肤后就可以纵向开口，然后往两侧撕开，可以保证颈部各组织位置不变动
原代细胞
原代细胞分离
REC
剔除无关组织
肌肉
骨膜
绣球
少部分结缔组织
消化液需前提平衡
轻微拧松瓶盖，提前置于二氧化碳培养箱中平衡
离心条件要温和
120g，5min，21-25摄氏度
DC
得率过低（正常CLN中分选得率为1%）
试剂未失效
磁珠未充分结合：进行二次孵育
试剂已失效
更换试剂
naive CD4+ T cell
得率过高（正常脾脏中分选得率为7%-15%）
BMDC
确保在取骨头时两端无破损
腹腔巨噬细胞
切勿破坏腹膜
最开始吸取腹腔灌洗液时，需手握小鼠，保持垂直方向，剑突开口需小一点，可以吸取液体即可，待吸取一部分后可将开口扩大
剪开腹膜后，小鼠侧位，拉扯一侧腹膜，使腹腔灌洗液在该部位积聚后吸尽
原代细胞培养
原代细胞完全培养基（1640+谷氨酰胺+非必需氨基酸+丙酮酸钠+β巯基乙醇）
非必需氨基酸、丙酮酸钠易失效
β巯基乙醇易挥发
发现臭味较为明显时就应该重新抽滤
换液过程中切勿戳破小室膜
要检查细胞因子是否失效
FLT3L诱导时需要关注细胞形态
诱导成功的细胞为漂浮的五角星状
每次换液和分化过程需将细胞吹散并与含细胞因子的完培混匀
流式细胞术
单细胞制备
过纱布
纱布需要绷紧
叠percoll
40%和80%之间分界需要很清楚，否则最后分离得倒的细胞层会很弥散
灵活变通，组织团块太大时不一定要按照固定体积的消化液来添加，可根据实际情况多加
样本上机
无流式数据
气泡未排干净
检查管路，并重新prime并高速跑水
有流式数据且细胞量多但是收样很慢
进样针堵塞
有流式数据，但细胞散点都集中在一侧
机器通道未完全打开
停止上样，重新启动软件或机器，待机器运转平稳后再上样
免疫组化
二甲苯、梯度乙醇需及时更换
新的一抗使用前需摸索一下稀释范围，且一抗4摄氏度孵育效果更佳
显色过程中需时刻关注阴性对照和样本的显色情况
苏木素染料易有沉淀，用前可用1ml注射器抽滤需要使用的量即可
盐酸乙醇分化时间不宜过长
活体成像
拍出的照片中荧光强的部位信号强度会影响荧光弱的部位
分开拍摄
可以选择一块黑色卡纸遮住不想观察且对实验信号输出有影响的部位
清理小鼠身上沾染的排泄物，会产生非特异性信号
western blot
loading较为黏稠，枪头不宜伸液面以下太深；吸出后需要将枪头外周刮一下（不仅在制样环节，也在后续的加样环节）
煮样后需静置冰上冷却，待冷凝水析出后，高速离心
防止加热后体积过度缩小
高速离心可使loading中的一些沉淀沉底，防止上样后跑的不均匀
点样需缓慢，防止样本飘出
转膜液重复用了两三次后会有滤纸碎屑，需及时更换
