蛋白质组学

这张思维导图系统地介绍了蛋白质组学中的多种技术方法，涵盖了凝胶电泳相关的检测、转印、免疫印迹实验，基于凝胶电泳的蛋白质组学分析技术，以及不依赖凝胶电泳的生物质谱分析方法，详细阐述了各项技术的原理、操作步骤和应用。

蛋白质组学

• 蛋白质凝胶电泳与检测
  • 蛋白质凝胶电泳
    • 蛋白质的SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚苯烯酰胺凝胶电泳）
      • 是根据蛋白质的分子量差异分离蛋白质
    • 非变性蛋白质凝胶电泳
      • 是指在不加入SDS和硫基乙醇等条件下进行聚苯烯酰胺凝胶电泳。对于需要保持活性的生物大分子的鉴定有重要意义
  • 凝胶上蛋白质的检测
    • 考马斯亮蓝染色
      • 二甲花青亮蓝，有机溶剂
    • 银染色
      • 灵敏度高，非常适合低峰度蛋白染色
    • 荧光染色
      • 灵敏度介于考马斯亮蓝染色和银染色之间，适用于蛋白质的整体表达和大规模蛋白质组研究，但价格昂贵，很少应用于大量凝胶的定量分析。
  • 凝胶转印与蛋白质免疫印迹实验
    • 蛋白质印迹是对转移至膜上的蛋白质进行连续分析的检测蛋白质表达的技术。将SDS-PAGE和高特异性的抗原抗体结合技术。
    • 蛋白质样品制备
      • 获得溶解状态的蛋白质提取液
    • SDS-PAGE
      • 蛋白质变性：SDS-蛋白质复合物
      • SDS-PAGE电泳：凝胶分为积层胶和分离胶。积层教的浓度为5%，主要用于蛋白质的浓缩和集中，分离胶浓度常为6%-15%，分离胶的靶蛋白越大，所需要的分离胶浓度越低。
    • 蛋白质转移
      • 将蛋白质从凝胶转移至固相膜，固相支持膜包括硝酸纤维素膜NC和聚偏氟乙烯膜PVDF。电转移可分为湿转和半干转。
    • 免疫学检测
      • 封闭：脱脂奶粉，牛血清白蛋白BSA、酪蛋白。为减少探针的非特异性结合，用非反应活性分子封阻转移膜上为吸附抗体的区域。
      • 靶蛋白与抗体结合：一抗 二抗
      • 检测：根据第二抗体连接的标识物进行检测，化学发光法，荧光检测法。
• 基于凝胶电泳的蛋白质组学分析
  • 双向凝胶电泳2-DE：是利用蛋白质的电荷数和分子量大小的差异，通过两次凝胶电泳进行蛋白质分离的技术（等电聚焦电泳IFE、SDS-PAGE）
  • 双向凝胶电泳差异蛋白图谱分析
    • 图像采集与加工 图像分析
  • 激光捕获显微切割技术LCM
    • 是一种高效、稳定，重复性强的获取样本的方法,它在显微镜下从组织切片中分离纯化单一类型细胞群或单个细胞，从而获得比较均匀的目标细胞。特点是精确，重复性好。
  • 双向凝胶电泳中蛋白质的定量分析
    • 双向荧光差异凝胶电泳：待比较的蛋白质组样品以不同的荧光（Cy2、Cy3、Cy5进行标记
• 不依赖凝胶电泳的蛋白质组学分析(生物质谱分析方法)
  • 基本原理
    • 蛋白质质谱技术 质谱分析仪
    • 质谱技术鉴定蛋白质的策略
      • 自下而上策略bottom-up:完整的蛋白质酶解消化成小分子肽段，借助软电离方法（ESI、MALDI）再进行质谱检测
      • 自上而下策略top-down：将整个蛋白质直接引入质谱仪，在质谱仪内部被解离为较小的片段。
  • 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术MALDI-TOF-MS
    • 以软离子为基础。关键的小分子物质基质.TOF基本原理是根据离子在得到能量后到达检测器的时间来反应离子的不同质量。
  • 电喷雾串联质谱技术ESI-MS
    • 在液态下完成，利用强静电场将带电液滴转变为气态离子。
    • 电喷雾串联质谱法测定蛋白多肽
      • 串联质谱技术通过对离子进行能量裂解而获得多肽序列相关结构信息,最常使用的裂解技术是与惰性气体撞击的碰撞诱导解离CID.
  • 肽质量指纹图谱
    • 对蛋白质特异性酶解的多肽混合物进行质谱分析的方法。用于大规模筛查、鉴定蛋白质来源。
    • 质谱鉴定蛋白质可通过肽质量指纹图谱和串联质谱两种方式。
  • 生物质谱的定量检测
    • 同位素标记的亲和标签ICAT
      • 精确检测出两个不同生物样品之间蛋白质组的组成和表达差异。
      • ICAT标签试剂包括3部分
    • 非标蛋白质定量技术
  • 生物质谱技术在蛋白质组学研究中的作用
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