第二章微生物的基础代谢

这是一篇关于第二章、微生物的基础代谢的思维导图，主要内容包括：一、能量代谢，二、葡萄糖分解代谢，三、微生物的合成代谢。

第二章、微生物的基础代谢

• 一、能量代谢
  • （一）能量代谢
    • 1、相关概念
      • （1）分解代谢
        • 大分子物质降解为小分子物质，并在这个过程中产生能量
          • 大分子物质来自体外摄取或自身合成多余的
          • 降解发生在胞内
      • （2）合成代谢
        • 小分子物质合成复杂大分子，并在这个过程中消耗能量
          • 小分子物质来自于体外摄取或者大分子物质降解，体外摄取更好
      • （3）微生物细胞所进行的所有生物化学反应均服从热力学的基本规律。生命系统通过将高焓低熵的基质转化成低焓高熵的代谢产物（基质的自由能大于产物的自由能），不断获得自由能
      • （4）代谢能支撑假说
        • 代谢能
          • 能直接推动生命活动（做细胞功）的能量形式叫做代谢能
        • 微生物细胞依靠其自备的能量转换机构，把化学能或光能持续地转化成代谢能，并直接用来支撑其自身的生命活动
          • 代谢能以高能磷酸键或电场的方式储存在代谢能的载体中，腺苷酸和可以被能量化的生物膜是最常见的代谢能载体
          • ATP（能量货币）和Δp（质子运动势）是代谢能最常见的供体
      • （5）
    • 2、能量偶合
      • 能量偶合的概念
        • 一种能量上可行的反应推动另一种在能量上不可行反应的过程
      • 能量偶合的方式
        • 有能量转移的偶合方式
          • 能量的转移通过形成高能中间体完成
            • 单酶催化单一反应
            • 多酶催化单一反应
        • 无能量转移的偶合方式
    • 3、能荷
      • 能荷概念
        • 细胞内所含有ATP、ADP和AMP三种核苷酸的比例，反映细胞的能势，可用来监测细胞生长期间的能量及相应酶活的变化
      • • （1）细胞生长旺盛时，合成出的ATP随即被迅速利用，细胞的能荷低
        • （2）生长后期，生长速率减慢，ATP的比例相对升高，能荷上升
        • （3）当细胞停止生长，能荷达到最高值
    • 4、总结
      • （1）生物物质的合成与分解常遵循同一化学变化途径进行，该途径是否相同则由能量关系的优势来决定
      • （2）合成或其他需能反应过程所需要的自由能由分解代谢提供
      • （3）自由能可由一个分子转移到另一个分子，转移时伴同磷酸根或其他原子基团的转移
  • （二）生物能产生与微生物生长之间的关系
    • 1、微生物能量形成机制与什么有关
      • 微生物自身
        • 呼吸链的复杂程度
        • 主要细胞组分的差异
      • 外部环境
        • 基质种类
        • 基质的代谢途径
        • 电子受体的数目
    • 2、合成细胞物质对ATP的需求
      • 不同微生物在同种培养基中生长，其YATP不相同
      • 微生物生长在复合碳源上可获得更高的YATP
        • 有能直接摄取的小分子
    • 3、能量溢出
      • 能量溢出的概念
        • 加进去的额外糖所产生的能量大部分被浪费掉，既没有用于生长也没有用于维持
      • 从发酵生理观点分析能量消耗的反应有
        • （1）细胞材料的合成
        • （2）维持细胞完整与存活的能量需求
        • （3）能量溢出反应
  • （三）胞内微环境
    • 1、定义
      • 广义的胞内微环境包括细胞内所有的物质组成和亚细胞结构的静态和动态信息
    • 2、主要包括
      • （1）真核细胞内部亚细胞结构的完整性，如线粒体等的结构和功能完整
        • 与原核微生物不同，真核微生物细胞中的细胞区隔可以使各种反应和产物分泌在各自最适条件下同时进行
      • （2）胞内各种辅因子的水平和存在形式，如ATP/ADP、NAD(P)H/NAD(P)、乙酰CoA/CoA等
        • 辅因子由碳中心代谢途径进行再生，但与普通的代谢中间产物不同，它们被很多代谢途径共享并存在一定的竞争，是胞内微环境的重要组成部分
      • （3）胞内各区间的各种基团和离子浓度，如Na+、K+、O2-和OH·等浓度
        • 特定的基团或离子浓度可以表征为一些宏观特征，如pH值（H+）、ROS（如O2-和OH·）及氧化还原电位（e-）
          • ROS（反应性活性氧）
            • ROS概念
              • 氧气在代谢过程中产生的一系列中间产物，如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢、单线态氧等，这些物质具有较强的氧化能力（高于氧），统称为活性氧物质
            • 胞内的ROS可通过激活和调控转录因子，调节细胞周期、基因的表达，从而参与细胞增殖、分化和凋亡等重要生理活动
      • （4）其它中间代谢产物或从外界吸收的化学物质
        • 某些代谢产物除了正常的代谢功能以外，还具有如维持胞内的渗透压等其他功能。如酵母中甘油、海藻糖和脯氨酸等
        • 相容物质
          • 某些物质在微生物体内的高浓度积累不仅不会阻碍细胞的正常生理过程，而且对胞内多肽、酶等活性分子的固有状态起到稳定和保护作用，这类物质统称为相容物质
    • 3、例子
      • 造血干细胞的代谢调控（线粒体、ROS、低氧）
        • 较老的线粒体
          • 线粒体膜电位增加，ROS增加，分化
        • 较少线粒体
          • 线粒体膜电位降低，ROS降低，自我更新
    • 4、影响胞内微环境的因素
      • （1）ATP供给对胞内微环境的调控
        • ATP供给是影响胞内微环境的最重要因素，只有在ATP供给充足的情况下
          • 细胞才能合成细胞膜和膜上的转运蛋白，实现维持胞内微环境最基本的亚细胞区间的区隔，从而维持各区间内的微环境
          • 一系列依赖于ATP的转运蛋白才能对各种离子进行选择性转运，从而维持胞内微环境
          • ATP是很多依赖于ATP的信号转导途径的重要信号和能量来源，通过一系列信号转导途径对胞内微环境进行全局性的调控
        • 胞内ATP供给水平的调控策略
          • 细胞内ATP主要来源于氧化磷酸化和底物水平磷酸化。对于好氧微生物来说，绝大多数ATP来源于氧化磷酸化。氧化磷酸化途径是调控好氧微生物胞内ATP含量及其形式的关键因素
            • 调控胞内NADH的供给（脱氢）
              • 敲除或过量表达与NADH代谢密切关联的代谢途径的关键酶
              • 添加促进NADH合成的底物
              • 构建氧化磷酸化竞争途径，过量表达NADH氧化酶，直接将NADH氧化为NAD+和水，不再通过氧化磷酸化途径，降低胞内ATP水平
            • 调控电子传递链活性（递氢）
              • 电子传递链是一个完整的系统，涉及到数十个结构基因和调控基因，很难通过过量表达某个或某些电子传递链中的相关基因促进ATP的生成；而破坏电子传递链的任一环节都能显著降低电子传递链活性，降低胞内ATP水平
                • 添加电子传递链抑制剂，如氰化物抑制细胞色素氧化酶，抗霉素能阻断细胞色素b到细胞色素c的电子传递，鱼藤酮可以阻断Fe-S中心到泛醌的电子传递
                • 选育呼吸缺陷型菌株，如缺失细胞色素a和b的突变株中，胞内ATP水平可比原始菌株降低25%
            • 调控电子受体供给（受氢）
              • 改变受体氧的供给是调控胞内ATP供给最为直接的方法
              • 溶氧控制、添加氧载体
            • 调控跨膜电势
              • ATP的合成依赖于跨膜电势，而跨膜电势依赖于胞内pH值及膜的通透性。细胞生长的环境pH值和其胞内pH值都对跨膜电势有一定影响，进而影响ATP合成
              • 在发酵培养基中添加一些化学物质，如二甲苯、2,4-二硝基苯酚等，可改变细胞膜对质子的通透性，影响跨膜电势，影响ATP的合成
        • 目标代谢产物合成与胞内ATP水平之间的关系
          • 较低ATP水平有利于目标代谢产物合成
            • 如丙酮酸和谷氨酸
          • 较高ATP水平促进代谢产物的合成
            • 如聚氨基酸和多糖类物质
          • 某些代谢产物在生产的不同时期对ATP的需求不同
            • 如四环素
      • （2）微生物细胞自身基因型所决定的代谢网络和信号转导途径
      • （3）微生物细胞所处的胞外环境
      • （4）细胞的生长阶段
    • 5、辅因子工程
      • （1）定向改变代谢流的方向使其通量最大化，同时还要定向改变和优化微生物的功能——改善微生物微环境。调节微生物细胞内辅因子的形式和浓度是改变和优化微生物功能的关键性因素之一
      • （2）辅因子工程定义
        • 采用分子生物学的手段，改造胞内辅因子的再生途径，调控细胞内辅因子的形式和浓度，定向改变和优化细胞代谢功能，实现代谢流最大化、快速地导向目标代谢产物
      • （3）辅因子工程所涉及的辅因子有
        • ATP/ADP/AMP
        • NADH/NAD+、NADPH/NADP+
          • 调控NAD（H/+）代谢的方式
            • 外源调节
              • 主要是指采用生化工程的方法，如添加外源电子受体、采用不同还原态碳源、添加NAD+前体物、改变溶氧、温度以及胞外氧化还原电位等实现对NADH代谢的调控
                • 添加外源电子受体调控NADH代谢
                  • 醛、酮、酸、分子氮或硝酸盐均能作为外源电子受体，加速NADH氧化。维持细胞处于最佳氧化还原状态（NADH/NAD+比例）
            • 内源调节
              • 指通过代谢工程的策略调节NAD（H/+）代谢相关酶的活性，如删除NADH竞争代谢途径或构建NAD（H/+）代谢途径
                • 在细胞内引入外源氧化还原代谢相关酶，改变胞内NADH生成或氧化途径，从而改变NADH/NAD+的比率
                • 胞质NADH需通过“穿梭”途径进入线粒体，实现NADH再氧化。如能在胞质中表达NADH氧化酶，可直接将胞质中的NADH氧化为NAD+，提高NADH氧化速度和效率
                  • 穿梭途径有磷酸甘油穿梭途径、苹果酸-天冬氨酸穿梭途径
        • 乙酰辅酶A及其衍生物
        • 维生素和微量元素
• 二、葡萄糖分解代谢
  • （一）为什么要研究葡萄糖分解代谢
    • 1、葡萄糖是化能异养型微生物的主要碳源/能源，葡萄糖分解代谢途径是中心代谢途径的主体
    • 2、葡萄糖降解途径是研究合成代谢途径的基础
    • 3、其他有机化合物包括糖、醇、醛、有机酸、氨基酸、脂类、烃类、芳香族化合物等也都是经转化后进入中心代谢途径
  • （二）微生物中葡萄糖分解代谢途径
    • 1、糖酵解途径（EMP）
    • 2、己糖单磷酸途径/磷酸戊糖途径（HMP）
    • 3、ED途径（KDPG途径）（存在于严格需氧的细菌中）
    • 4、磷酸解酮酶途径（PK）（只存在于细菌中）
    • 葡萄糖直接氧化途径
    • 5、三羧酸循环（TCA）
    • 6、三羧酸循环的补给反应系统
    • 7、乙醛酸循环
  • （三）EMP途径
    • • 1、关键酶
        • 磷酸果糖激酶（PFK）
          • 变构酶，受到多种因子的控制，是EMP途径代谢流的主要“阀门”，与HMP途径关联
        • 1,6-二磷酸果糖醛缩酶（FDPA）
          • 催化EMP途径中6C裂解成3C的反应
      • 2、关键化合物
        • 6-磷酸葡萄糖
          • 进入HMP、进入EMP、通过变为1-磷酸葡萄糖，在UTP的作用下转化为多糖、细胞壁等
        • 3-磷酸丙糖
          • 磷酸二羟丙酮，合成脂肪、膜磷脂
        • 3-磷酸甘油酸
          • 合成丝氨酸、甘氨酸等
        • 丙酮酸
          • 进入TCA循环、合成丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸等
      • 3、EMP途径的调节
        • 目前认为控制糖酵解流量的因素有
          • 葡萄糖转运及其磷酸化
            • 葡萄糖转运对糖酵解的调节
              • 对于酵母细胞
                • 己糖转运速度由己糖转运蛋白的活性和数量决定，当氮源受到限制或蛋白质合成受到限制时，一些己糖通透酶失活；每种己糖转运蛋白所起的作用不同
                • 己糖转运蛋白受高度调控，不但受可利用的糖浓度的调节，而且受渗透压、营养缺乏及细胞所处的生理状态的调节
                  • 当葡萄糖浓度高，转运蛋白与葡萄糖结合力低
                  • 当葡萄糖浓度低，转运蛋白与葡萄糖结合力高
            • 葡萄糖磷酸化对糖酵解的调控
              • 无论是在酵母细胞还是细菌中单一或者过量表达糖酵解关键酶并不能有效或者大量提高糖酵解速率
              • 糖酵解速率应该是由几个关键酶或者糖酵解所有酶的活性所控制。只有过量表达糖酵解途径中多个或者全部关键酶的活性，才能提高糖酵解流量和产物生产强度
              • 控制糖酵解速率的因素除葡萄糖转运和磷酸化外，还可能存在于糖酵解途径之外，如氧化磷酸化途径和NAD+再生途径
          • 糖酵解关键酶的活性
          • 微生物细胞的能量代谢
          • NADH再生与氧化途径
  • （四）HMP途径
    • • 1、关键酶
        • 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）
          • 调节HMP和EMP途径通量
        • 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（GA6PDH）
          • 调节HMP和ED途径通量
      • 2、关键化合物
        • 5-磷酸核糖
          • 合成嘌呤、嘧啶核苷酸
        • 4-磷酸赤藓糖
          • 合成芳香族氨基酸的前体
        • 6-磷酸葡萄糖
          • 与EMP关联
        • 6-磷酸葡萄糖酸
          • 与ED途径关联
      • 3、提供还原力NADPH，提供碳骨架
      • 4、EMP和HMP途径的关系
        • EMP和HMP途径都用到6-磷酸葡萄糖，但是其代谢流的分布往往取决于细胞的生理状态
          • 细胞生长旺盛时，EMP和HMP途径的物流比大致为2：1
          • 细胞生长缓慢时，所需的C5、C4糖和NADPH减少，两途径的物流比迁移到10：1，甚至20：1
  • （五）ED途径
    • • 1、ED途径可能是大多数假单胞菌降解葡萄糖的主要代谢途径；发酵运动单胞菌是目前所知的唯一能在厌氧条件下使用ED途径的微生物
      • 2、特征反应
        • KDPG裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油酸
      • 3、特征酶
        • KDPG醛缩酶
        • 6-磷酸葡萄糖酸脱水酶
          • 与HMP途径关联
      • 4、关键化合物
        • 6-磷酸葡萄糖酸
      • 5、途径中所获得的两个丙酮酸来历不同
  • （六）PK途径
    • • 1、关键酶
        • 磷酸戊糖解酮酶
      • 2、关键化合物
        • 5-磷酸木酮糖
        • 乙醇
        • 乙酸
      • 3、HPK途径
        • • 双歧杆菌和木醋杆菌中发现
  • （七）葡萄糖直接氧化途径
    • 以上4种途径（EMP、HMP、ED、PK/HPK）的第一步均是在己糖激酶的催化下首先把葡萄糖激活成6-磷酸葡萄糖后才开始降解，而有些微生物如假单胞菌属和气杆菌属中某些种的细菌没有己糖激酶，则葡萄糖分解走直接氧化途径
      • • 葡萄糖直接氧化途径在有分子氧的存在下运行
  • （八）丙酮酸的代谢
    • • 1、产物
        • 生成乳酸
          • 厌氧条件下，厌氧的乳酸菌经EMP途径产生的丙酮酸作为H的受体，产生乳酸
        • 生成乙醇、乙酸
          • 酵母菌和其他微生物
        • 氧化成CO2和水
      • 2、三羧酸循环
      • 3、丙酮酸代谢走哪条途径，取决于微生物中是否存在该途径的酶
      • 4、不同的代谢途径影响到目标产物的产量和产率，影响有机原料的利用率
        • 乳酸发酵
          • • 菌种
              • 乳酸杆菌、链球菌
            • 特征
              • 1分子葡萄糖产生2分子乳酸和2分子ATP，不产生CO2
          • • 菌种
              • 肠膜明串珠菌、葡萄糖明串珠菌
            • 特征
              • 1分子葡萄糖产生乳酸、乙醇和CO2各1分子，产生1分子的ATP
        • 乙醇发酵
          • • 酵母菌
              • 该乙醇发酵过程只在pH3.5-4.5以及厌氧的条件下发生
          • • 运动发酵单胞菌
            • 不产ATP
  • （九）其他单糖的分解
    • 1、果糖的分解
    • 2、甘露糖的分解
    • 3、半乳糖的分解
    • 4、戊糖的分解
    • 5、4C进入TCA，3C进入EMP，都是要先变成5C/6C
  • （十）乙醛酸循环
    • • 在无丙酮酸提供前体情况下，使TCA运转
      • 提供草酰乙酸来源
  • （十一）三羧酸循环的补给反应系统
  • （十二）拓展实例
    • 1、酵母菌发酵生产丙酮酸
      • （1）利用烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素多重维生素营养缺陷型作为发酵生产丙酮酸的菌株，只能依靠外源的烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素才能生长，能以无机氮源为唯一氮源生长
      • （2）这些维生素中，硫胺素最重要。硫胺素缺乏，丙酮酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶活性下降，丙酮酸氧化脱羧受阻，使得丙酮酸积累
      • （3）硫胺素缺乏
        • HMP途径受阻
        • NADPH合成速率下降
        • 细胞物质合成速率降低
        • 细胞增殖速度变慢
      • （4）结果
        • 丙酮酸产率高
        • 葡萄糖消耗速度慢
      • （5）ATP主要来源于EMP
    • 2、L-苹果酸过量积累
      • L-苹果酸的合成途径
        • • 增强丙酮酸的积累
            • 较少丙酮酸的下游途径流量
          • 增强苹果酸的产量
            • 选择更优势的酶，减少苹果酸的流出
          • 改善胞内微环境，加速葡萄糖的消耗
• 三、微生物的合成代谢
  • （一）了解合成代谢途径比分解代谢途径难得多，研究分解代谢途径可在细胞萃取液离体条件下进行，而研究合成代谢途径要用完整的活细胞
    • 研究合成代谢的方法
      • 1、同位素示踪法
        • 将同位素示踪元素如32P、14C、3H、15N、35S引入到细胞营养物或代谢产物中，然后跟踪其标记原子转化为细胞组成的代谢途径
          • （1）同位素标记法
            • 标记元素在产物中的分布
          • （2）同位素稀释法
            • 若怀疑某种化合物是中间体，但是难以合成带标记的化合物时，可采用此方法。先加另一种已知为前体的带同位素标记的化合物，检测产物。再加入怀疑的化合物，看同位素信号是否变弱
      • 2、应用代谢缺陷生化突变株来分析合成途径
        • 顺序归纳法
          • 先确定一个合成反应途径的酶催化反应的数目。一个途径中有多少种酶促反应就能获得多少种营养突变株，找到所有营养突变株，即可知道酶促反应的数目。然后确定酶促反应的先后顺序，通过互补实验确定
            • 互补实验
              • 两个营养缺陷突变株分别放在两个基本培养基上培养均不会生长，如果把两个营养缺陷突变株放在同一个基本培养基上培养且挨得很近，则营养缺陷阻断在前面的会长，在后面的不长
      • 3、同位素示踪法和遗传分析技术联合应用
  • （二）氨基酸的合成
    • • 1、微生物3种同化NH3的反应
        • • 影响微生物氨同化途径的因素
            • 生长条件
              • 大肠杆菌及G-菌，如果有氨存在并且以葡萄糖为碳源时，Glu脱氢酶活性高。氨同化走合成Glu的途径
              • 同样的菌，生长在混合氨基酸中，Asn合成酶活性高，Glu脱氢酶活性低，氨同化途径走Asn合成途径
            • 氨的浓度
              • 氨浓度高
              • 氨浓度低
      • 2、计算能量代价
        • （1）谷氨酸
        • （2）天冬氨酸
        • （3）丙氨酸
        • （4）丝氨酸
      • 3、芳香族氨基酸的合成（莽草酸途径）
        • • 芳香族氨基酸细胞工厂构建
            • 改造策略
              • （1）增加前体供给
              • （2）解除关键酶反馈抑制和阻遏抑制
              • （3）改造转运系统
              • （4）改善胞内微环境
              • （5）菌株生长与产物合成耦联
              • （6）高通量高产菌株的筛选
              • （7）培养基和培养条件的优化
      • 4、组氨酸的合成
      • 5、赖氨酸的合成
        • （1）原核生物
          • 二氨基庚二酸途径（DAP）
        • （2）真核生物
          • a-氨基己二酸途径（a-AAA）
  • （三）经氨基酸途径的含氮化合物的生物合成
    • 原核生物从氨基酸合成途径衍生的最重要的含氮化合物是多胺，是由谷氨酸途径的精氨酸支路合成的
      • • 1、多胺包括
          • （1）丁二胺（腐胺）
            • 调节细胞内渗透压
          • （2）精胺
          • （3）亚精胺
            • 激活细胞自噬而延长寿命
        • 2、细菌生长期，多胺和精氨酸的合成大致相同
          • 无外源精氨酸时，由鸟氨酸合成的多胺占优势
          • 有外源精氨酸供给时，细胞本身合成精氨酸停止，细胞直接利用外源精氨酸合成多胺
  • （四）聚类异戊二烯化合物的合成
    • 甲羟戊酸途径
      • • 1、细胞成分所具有的碳架是由重复的C5单位组成
        • 2、异戊二烯单位是许多次级代谢产物的前体
  • （五）糖磷酸酯与糖核苷酸
    • 糖核苷酸的功能
      • 作为某些单糖相互转换的机构
        • 细胞内无游离的糖
      • 在多糖合成中作为糖基的给体
    • 透明质酸的合成
      • 需要UDP
  • （六）核苷酸的生物合成
    • 所有核苷酸前体的核糖磷酸部分是由同一前体5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）衍生的，5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）是从5-磷酸核糖起始合成的
  • （七）糖-蛋白质-脂类之间的代谢关系
    • 1、糖与脂肪
    • 2、糖与蛋白质
    • 3、脂肪与蛋白质