重组DNA分子的转与增、转化子的筛选与重组子鉴定、目的基因克

这是一篇关于重组DNA分子的转与增、转化子的筛选与重组子鉴定、目的基因克的思维导图

重组DNA分子的转与增、转化子的筛选与重组子鉴定、目的基因克隆

• 转与增
  • 转化率
    • 定义：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数
    • 用途：利用转化率和重组率等参数能够帮助设计DNA重组实验
    • 影响因素：载体本身的性质；载体的空间构象；插入片段的大小
  • 转化方法
    • 钙离子诱导转化
    • PEG介导的细菌原生质体转化
    • 电穿孔驱动的完整细胞转化
    • 接合转化
    • λ噬菌体的转染
  • 转化细胞的扩增
    • 转化细胞的增殖；使得有足够数量的转化细胞用于筛选环节
    • 载体DNA上携带的标记基因拷贝数扩增及表达，这是进行筛选与单元操作的前提条件
    • 克隆的外源基因的表达，如果重组DNA分子的筛选与鉴定依赖于外源基因表达产物的检测
• 检
  • 载体遗传标记检测
    • 抗药性筛选法：前提是载体DNA上携带有受体细胞敏感的抗生素的抗性基因
    • 营养缺陷型筛选法：可以区分转化子与非转化子。转化细胞在营养组分培养基上长出来的便是转化子
    • 显色模型筛选法：可以区分转化子与非转化子也可以区分重组子与非重组子。载体分子携带显色酶基因，产生颜色反应
    • 噬菌斑筛选法：以λ-DNA为载体的重组DNA分子经体外包装后转染受体菌，转化子在固定固定培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长
  • 克隆DNA序列检测
    • PCR鉴定法：根据引物互补区域不同，PCR技术可以区分重组子与非重组子，又能鉴定目的重组子与非目的重组子，还可以探测目的基因或DNA片段是否整合在受体细胞的基因组上
    • 菌落原位杂交法
      • 原理：根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此筛选目的基因的目的重组子
      • 探针的制备：1)目的基因的同源序列；2）cDNA序列；3）人工合成寡聚核苷酸
      • 探针的标记：1）5‘末端标记法；2)反转录标记法；3）缺口前移标记；4）ABC标记法
    • 限制性酶切图谱法
    • 亚克隆法
    • DNA测序法
      • 双脱氧末端终止测序法
      • DNA大片段的测序战略
      • DNA测序技术发展
  • 外源基因产物检测
    • 蛋白质生物功能检测法
    • 蛋白凝胶电泳检测法
• 目的基因克隆
  • 鸟枪法（shotgun)
    • 基本战略
      • 染色体DNA的切断
        • 超声波处理：长度均已，大小可控，平头末端
        • 全切酶：长度不均一，粘性末端，便于连接但可能使目的基因断开
        • 部分酶切：长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
      • 与载体连接
        • 若转化子采用限制性酶切图谱法则选择多拷贝克隆数，若为基因功能检测法筛选则选择表达型载体
      • 转化受体细胞
        • 若转化子采用限制性酶切图谱法则选择目的基因表达受体细胞，若为基因功能检测法筛选则选择能使目的基因表达的受体细胞
      • 筛选含有目的基因对的重组子
        • 菌落原位杂交发、基因产物功能检测法
    • 局限性
      • 工作量大；不能获得最小长度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的内含子
    • 目的基因组DNA片段的制备
      • 超声波处理；限制性内切酶部分酶解；特定限制性内切酶全解酶
  • cDNA法
    • 基本战略
      • cDNA第一条链的合成
      • cDNA第二条链的合成
        • 自身合成法：获得的双链cDNA5'端会有几对碱基缺失
        • 置换合成法：获得的双链cDNA5'端也会有几对碱基缺失
        • 引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5'端序列