细胞生物学研究方法

细胞生物学研究方法思维导图，包括细胞形态结构的观察方法、细胞及其组分的分析方法、模式生物与功能基因组的研究、细胞及生物大分子的动态变化等内容。

细胞生物学 研究方法

• 一、细胞形态结构的观察方法
  • （一）光学显微镜
    • 普通复式光学显微镜
    • 相差显微镜
      • 基本原理：在普通光学显微镜的基础上，添加了环状光阑和相差版，从而可将这种光程差和相位差通过光的干涉作用转换成振幅差（观察活细胞显微结构细节）
    • 微分干涉显微镜 （Nomarski相差显微镜）
      • 基本原理：以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分为两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜，将这两束光会合，从而使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别（适合研究活细胞）
    • 荧光显微镜
      • 基本原理：是指在光镜水平上对细胞内特异的蛋白质核酸，糖类，脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具。
      • 荧光
        • 自发荧光
        • 诱发荧光
      • 核心部件
        • 滤光片系统
          • 激发滤光片（安装在光源和样品之间，只允许特定波长的激发光通过）
          • 阻断滤光片（安装在物镜和目镜之间，只容许荧光染料所发出的荧光通过）
        • 物镜镜头
      • 荧光显微镜样品制备技术
        • 1.免疫荧光技术（基于抗体和抗原间特异的反应）
        • 2.荧光素直接标记技术（染料特异性与DNA结合）
        • 3.绿色荧光蛋白（GFP的基因与编码某种蛋白质的基因相融合）
    • 激光扫描共焦显微镜 （LSCM.简称共焦显微镜）
      • 基本原理：是指聚光镜和物镜，同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像，再利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理，汇聚每一个点上的信息，形成一幅清晰的二维图像
    • 超高分辨率显微术
      • 1.全内反应荧光显微术（TIRFM）
      • 2.基于单分子成像技术的PALM/STORM方法
        • PALM：单分子
        • STORM：内源蛋白
      • 3.4π和STED显微术
      • 4.结构照明显微术
  • （二）电子显微镜
    • 与光学显微镜的区别
      • 1.电子束作为光源
      • 2.电磁透镜聚焦
      • 3.电镜镜筒高度真空
      • 4.图像需要通过荧光屏、感光胶片或电荷耦合器件（CCD）进行显示和记录
    • 基本构造
      • 1.电子束照明系统
      • 2.成像系统
      • 3.真空系统
      • 4.记录系统
    • 主要电镜制样技术
      • 1.超薄切片技术
        • 取材
        • 固定
        • 包埋：目前常用的包埋剂是各种环氧树脂
        • 切片：最常用的是玻璃刀
        • 染色：用重金属盐进行染色，如锇酸→脂质，柠檬酸铅→蛋白质，乙酸双氧铀→核酸
        • 观察
      • 2.负染色技术
        • 原理：使用重金属盐染色，重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色
      • 3.冷冻蚀刻技术
        • 过程：包括冰冻断裂和蚀刻复型
        • 应用：观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征
      • 4.电镜三维重构与低温电镜技术
        • 电镜三维重构技术
        • 低温电镜技术：膜蛋白、核糖体、30nm染色质、病毒颗粒
        • 电子断层成像技术：细胞器、细胞骨架、膜泡运输系统、蛋白质复合体
        • 扫描电镜背散射电子成像：研究细胞、组织等更大尺度的超微结构的三维结构
      • 5.扫描电镜技术
  • （三）扫描隧道显微镜
• 二、细胞及其组分的分析方法
  • （一）用超离心技术分离细胞组分
    • 差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开
    • 密度梯度离心
      • 原理：将要分离的细胞组分小心的铺放在含有密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质（如蔗糖）形成的密度梯度溶液表面，通过重力或离心力的作用，使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带
      • 速度沉降：主要适用于分离密度相近，而大小不一的细胞组分
      • 等密度沉降：用于分离不同密度的细胞组分
      • 常用的介质：蔗糖、氯化铯
  • （二）特异蛋白抗原的定位与定性
    • 免疫荧光技术
      • 原理：将免疫学方法（抗原－抗体特异结合）与荧光标记技术相结合，用于研究特异蛋白抗原在细胞内的分布
      • 分类
        • 直接免疫荧光技术：将荧光分子与抗体偶联后，直接用于免疫标记技术
        • 间接免疫荧光技术：先将抗体（称第一抗体）与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体（称第 二抗体）
      • 步骤：荧光抗体的制备、标本的处理、免疫染色、观察技术
    • 免疫电镜技术
      • 免疫铁蛋白技术
      • 免疫酶标技术
      • 免疫胶体金技术
      • 步骤：样品的固定、包埋、超薄切片制备、免疫标记、染色
  • （三）细胞内特异核酸的定位与定性
    • 原位杂交
      • 原理：用标记的核酸探针，通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法成为原位杂交
      • 光镜水平（同位素标记或荧光素标记的探针）
      • 电镜水平（生物素标记的探针与抗生素抗体相连胶体金标记结合）
  • （四）细胞成分的分析与细胞分选技术
    • 流式细胞术
• 五、模式生物与功能基因组的研究
• 四、细胞及生物大分子的动态变化
  • （一）荧光漂白技术（FPR）
    • 利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的淬灭，这一区域：原理 称光漂白区，随后由于细胞中脂质分子或蛋白质分子的运动，周围非漂白区的荧光分子不断向光漂白 去迁移，结果使光漂白区的荧光强度逐渐的恢复到原有水平，这一过程称荧光恢复。
  • （二）酵母双杂交技术
    • 细胞基因转录起始需要转录激活因子的参与，其转录激活因子一般有两个或两个以上相互独立的结构：基本原理 域构成，即DNA结合域（DB，可识别DNA上的特异转录调控序列并与之结合）和转录激活域（AD， 可与其他成分作用形成转录复合体），从而启动它所调节的基因的转录。
  • （三）荧光共振能量转移技术
    • 检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用：作用
    • FRET现象发生的条件
      • D、A都能发生荧光
      • D的发射光谱和A的吸收光谱有部分重叠
      • D、A之间的距离小于10nm
    • 两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光倍YFP接收的量就越多，检测器所接收到的 蓝色荧光就越弱，而黄色荧光就越强，反之就不会出现FRET现象
  • （四）放射自显影技术
    • 利用放射性同位素的电离射线对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行 定性，定位与半定量研究的一种细胞化学技术
    • 步骤
      • 同位素标记的生物大分子前体的掺入
      • 细胞内同位素所在位置的显示
    • 持续标记
    • 脉冲标记
• 三、细胞培养与细胞工程
  • （一）细胞培养
    • 动物细胞培养
      • （从机体取出后，立即进行传代培养后的细胞）：传代细胞
      • （传至10代以内的细胞）：原代细胞
      • 细胞系
        • ：度过危机又可顺利地传40至50代的，并且仍保持原来染色体的2倍体数目及接触抑制的行为的细胞：名词解释
        • 传代次数有限的体外培养细胞：有限细胞系
        • （连续细胞系）永生细胞系
          • 有可能在培养条件下无限制地传代培养下去的细胞：名词解释
          • 染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制，容易传代培养：特点
          • HeLa细胞系、CHO细胞系：举例
      • 具有特殊的遗传标记或性质，这样的细胞系称为细胞株：细胞株
      • 成纤维样细胞、上皮样细胞，此外还有一些可移动的游走细胞：基本形态
      • 贴壁培养和悬浮培养：培养方法
    • 植物细胞培养
      • 细胞培养
      • 原生质体培养
  • （二）细胞工程
    • 细胞融合与单克隆抗体技术
      • 灭活的病毒、化学物质（PEG）、电融合技术：细胞融合
      • 同核体
      • 异核体
      • 合核体
      • 用抗原免疫小鼠→免疫脾细胞 + →杂交瘤细胞→选择培养→阳性克隆的筛选及克隆化→扩增：单克隆抗体制备 骨髓瘤细胞培养→骨髓瘤细胞 （PEG） （HAT培养基）
    • 把细胞核与细胞质分离开，然后把不同来源的胞质体：细胞拆合：显微操作技术与动物的克隆 和核质体相互组合，形成核质杂交细胞