导图社区 DNA重组及重组DNA技术
《生物化学与分子生物学》第二十一章 DNA重组及重组DNA技术笔记,包括自然界的DNA重组和基因转移、重组DNA 技术、重组DNA 技术在医学中的应用等内容。
编辑于2021-10-24 13:32:55思维导图总结了2025年高考报名本科专业,包括 13个学科门类(如工学、理学、艺术学等)及其下设的专业大类和具体专业。通过层级结构清晰展示学科分类,并突出交叉学科和国家战略相关专业,帮助考生、教师快速了解专业布局变化,为志愿填报和学科规划提供参考。
总结主编钟赣生的《中药学》知识点,包含解表药、清热药、泻下药、祛风湿药等21个章节的内容,由于考虑文件太大的缘故,只展示前两章药物的图片。希望对大家学习《中药学》这一课程有所帮助。
总结化学研究生必会技能,包含文献阅读、组会回报、实验操作、数据处理、论文撰写,这些常见问题的处理和总结。
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21 第二十一章 DNA重组及重组DNA技术
自然界的DNA重组和基因转移 P418
同源重组是最基本的 DNA 重组方式
在 Holliday 模型中,同源重组主要经历四个关键步骤:
①两个同源染色体 DNA 排列整齐
②一个 DNA 的一条链断裂 、并与另一个 DNA 对应的链连接,形成 Holliday 中间体
③通过分支移动产生异源双链 DNA
④Holliday 中间体切开并修复,形成两个双链重组体DNA。切开的方式不同,所得到的重组产物也不同。如果切开的链与原来断裂的是同一条链,重组体含有一段异源双链区,其两侧来自同一亲本 DNA,称为片段重组体。 但如切开的链并非原来断裂的链(模型左边的产物),重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA,称为拼接重组体
RecBCD 复合物具有三种酶活性,即依赖于 ATP 的核酸外切酶活性、可被 ATP 增强的核酸内切酶活性以及需要 ATP 的解螺旋酶活性
RecA 蛋白可结合单链DNA( ssDNA),形成 RecA-ssDNA 复合物
RuvC 有内切酶活性,能专一性识别 Holliday 连接点,并有选择地切开同源重组体的中间体
位点特异性重组是发生在特异位点间的 DNA 整合
λ 噬菌体 DNA 的整合
细菌的位点特异性重组
免疫球蛋白基因的重排
转座重组可使基因移位
插入序列转座
转座子转座
与 IS 类似,Tn 也是以两个反向重复序列为侧翼序列,并含有转座酶基因;与 IS 不同的是, Tn 含有抗生素抗性等有用的基因
原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组
接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时,质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌),这种类型的 DNA 转移称为接合作用
转化作用
通过自动获取或人为地供给外源 DNA,使受体细胞获得新的遗传表型,这就是转化作用
转导作用
当病毒从被感染的细胞(供体)释放出来、再次感染另一细胞(受体)时,发生在供体与受体细胞之间的 DNA 转移及基因重组即为转导作用
特异性转导的基本过程
①当噬菌体感染供体菌后,噬菌体 DNA 被位点特异性地整合于供体菌染色体 DNA 上
②当整合的噬菌体 DNA 从供体菌染色体 DNA 上切离时,可携带位于整合位点侧翼的 DNA 片段,随后切离出来的噬菌体 DNA 被包装人噬菌体衣壳中
③供体菌裂解,所释放出来的噬菌体感染受体菌,继而,携带有供体菌 DNA 片段的噬菌体 DNA 整合于受体
菌染色体 DNA 的特异性位点上。这样,就把位于整合位点侧翼的供体菌的 DNA 片段重组到了受体菌染色体 DNA 上
重组 DNA 技术 P423
重组 DNA 技术中常用的工具酶
RE的命名采用H.0.Smith和D.Nathane提出的细菌属名与种名相结合的命名法
①第一个字母是酶来源的细菌属的词首字母,用大写斜体
②第二及第三个字母是细菌种的词首字母,用小写斜体
③第四个字母(有时无),表示分离出这种酶的细菌的特定菌株,用大写或小写
④罗马数字表示酶发现的先后顺序
例如 EcoR I 的命名:E=Escherichia,埃希菌属;co=coli,大肠杆菌菌种;R=RY13,菌株名; I =在相应菌株中第一个被分离到的内切酶
重组 DNA 技术中常用的载体
克隆载体
克隆载体应具备的基本特点
①至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制,并能使克隆的外源 DNA 片段得到同步扩增
②至少有一个选择标志:选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的,包括抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、营养缺陷耐受基因等
③有适宜的RE的单一切点:载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列,在这段序列中包含了多个RE的单一切点,可供外源基因插人时选择,这样的序列称多克隆位点(MCS)
常用的克隆载体
质粒
质粒是主要存在于细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的DNA分子,通常为环状双链的超螺旋结构
有的质粒与细菌染色体同步复制,处于严密控制之下,该类质粒称严紧型质粒,其拷贝数较低
有的质粒的复制快于细菌染色体复制(即质粒复制不受严格控制),该类质粒称松弛型质粒,其拷贝数很高。重组DNA技术中使用的质粒通常是松弛型
噬菌体DNA
常被用作克隆载体的噬菌体 DNA 有 λ 和 M13 噬菌体 DNA 。
稍早经 λ 噬菌体 DNA 改造成的载体系统有 λgt 系列(插入型载体,适用于 cDNA 克隆)和 EMBL 系列(置换型载体,适用于基因组 DNA 克隆)
经改造的 M13 载体有 M13mp 系列及 pUC 系列
其他克隆载体
为增加克隆载体插入外源基因的容量,还设计有柯斯质粒载体(又称黏粒载体)、细菌人工染色体(BAC)载体和酵母人工染色体(YAC)载体等
表达载体
原核表达载体
该类载体用于在原核细胞中表达外源基因,由克隆载体发展而来
真核表达载体
该类载体用于在真核细胞中表达外源基因,也是由克隆载体发展而来的,故含有必不可少的原核序列,包括在大肠杆菌中起作用的复制起点抗生索抗性基因、MCS等,这些原核序列便于真核表达载体在细菌中复制以及阳性克隆的筛选
真核表达载体自身的特点
①真核表达调控元件,包括启动子、增强子、转录终止序列、poly A加尾信号等
②真核细胞复制起始序列
③真核细胞药物抗性基因,用于转人真核细胞后进行阳性克隆的筛选
重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤
目的DNA的分离获取——分
化学合成法
从基因组 DNA 文库和 cDNA 文库中获取目的 DNA
PCR 法
其他方法
载体的选择与构建——选
进行DNA克隆的目的主要有二
①获得目的DNA片段
②获得目的DNA片段所编码的蛋白质
针对第一种目的,通常选用克隆载体;针对第二种目的,需选用表达载体
目的 DNA 与载体连接——接
黏端连接
单一相同黏端连接
不同黏端连接
通过其他措施产生黏端进行连接
常用的在末端为平端的目的 DNA 片段制造黏端的方法有
①人工接头法:化学合成法获得含有 RE 切点的平端双链寡核苷酸接头,将此接头连接在目的 DNA 的平端上,然后用相应的 RE 切割人工接头产生黏端,进而连接到载体上
②加同聚物尾法:用末端转移酶将某单一核苷酸( 如 dC)逐一加到目 的 DNA 3'-端的羟基上,形成同聚物尾(如同聚 dC尾);同时又将与之互补的另一核苷酸(如 dG)加到载体 DNA 3'-端的羟基上,形成与目的DNA 末端同聚物尾互补的同聚物尾(如同聚 dG尾)。两个互补的同聚物尾均为黏端,因而可高效率地连接到一起
③PCR 法:针对目的 DNA 的 5'-和 3'端,设计一对特异引物,在每条引物的 5'-端分别加上不同的 RE 位点然后以目的 DNA 为模板,经 PCR 扩增便可得到带有引物序列的目的 DNA,再用相应 RE 切割 PCR 产物,产生黏端,随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。另外,在使用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 时,扩增产物的 3'-端可加上一个单独的腺苷酸残基(A)而成为黏端,这样的 PCR 产物可直接与带有 3'-T的线性化载体(T载体)连接,此即T-A克隆
平端连接
黏-平末端连接
重组DNA转入受体细胞——转
转化
转染
感染
重组体的筛选与鉴定——筛
借助载体上的遗传标志进行筛选
利用抗生素抗性标志筛选
利用基因的插人失活/插入表达特性筛选
利用标志补救筛选
利用噬菌体的包装特性进行筛选
序列特异性筛选
RE 酶切法
PCR 法
核酸杂交法
该方法可直接筛选和鉴定含有目的 DNA 的克隆
DNA测序法
该法是最准确的鉴定目的DNA的方法
克隆基因的表达
原核表达体系
运用 E. coli 表达有用的蛋白质必须使构建的表达载体符合下述标准
①含大肠杆菌适宜的选择标志
②具有能调控转录、产生大量 mRNA 的强启动子,如 lac、tac 启动子或其他启动子序列
③含适当的翻译控制序列,如核糖体结合位点和翻译起始点等
④含有合理设计的 MCS,以确保目的基因按一定方向与载体正确连接
E.coli表达体系在实际应用中尚有一些不足之处
①由于缺乏转录后加工机制,E.coli 表达体系只能表达克隆的 eDNA,不宜表达真核基因组 DNA
②由于缺乏适当的翻译后加工机制,E.coli 表达体系表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰
③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体,欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理
④很难在 E.coli 表达体系表达大量的可溶性蛋白
真核表达体系
真核表达载体通常含有选择标记、启动子、转录和翻译终止信号、mRNA 加 polyA 信号或染色体整合位点等
重组 DNA 技术在医学中的应用 P433
重组 DNA 技术广泛应用于生物制药
重组 DNA 技术还应用于医学的其他诸多方面