基因结构与功能分析技术

《生物化学与分子生物学》第二十二章基因结构与功能分析技术笔记，包括基因结构分析技术、基因表达产物分析技术、基因的生物学功能鉴定技术等内容。

22 第二十二章 基因结构与功能分析技术

• 基因结构分析技术 P436
  • 基因一级结构解析技术
    • 双脱氧法和化学降解法是两种常规的DNA测序方法
      • 化学降解法的特异性基于第一步反应，其中肼、硫酸二甲酯或甲酸仅与DNA链上小部分的特定碱基发生作用，而第二步的哌啶断裂必须是定量反应。第一步反应的化学机制如下
        • ①G反应：用硫酸.二甲酯对 G 的 N7 进行甲基化，其后断开 C8-N9 间的化学键，哌啶置换了被修饰的 G 与核糖结合
        • ②A+G 反应：甲酸使嘌呤环上的N原子质子化，从而削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤
        • ③C+T反应：肼打开嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换
        • ④C反应：在 NaCl 存在时，只有 C 可同肼发生反应，随后被修饰的 C 由哌啶置换
    • 全自动激光荧光 DNA 测序技术的原理基于 Sanger 双脱氧法
      • 四色荧光法
      • 单色荧光法
    • 焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷酸的测序技术
      • 焦磷酸测序技术的原理
        • ①一条特异性测序引物与单链模板 DNA 退火后，加入酶混合物和底物混合物，其中酶混合物中包括 DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶；底物混合物中包括 5'-磷酸化硫酸腺苷(APS)和虫荧光素
        • ②向反应体系中加人一种 dNTP，如果它和 DNA 模板的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚合酶作用下，添加到测序引物的 3'-末端，同时释放出一分子焦磷酸(PPi)
        • ③在三磷酸腺苷硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 与 APS 结合形成 ATP；在荧光素酶的催化下，生成的 ATP 与荧光素结合形成氧化荧光素，同时发光，最大波长约为 560nm，荧光信号强度(即峰值的高低)与聚合的 dNTP 个数成正比
        • ④反应体系中剩余的 dNTP 和残留的少量 ATP 在三磷酸腺苷双磷酸酶的作用下发生降解
        • ⑤加入另一种 dNTP，重复第 ②~④ 步反应。通过这种循环反应，根据加人的 dNTP 类型和荧光信号强度(峰值的高低)，就可实时读取模板 DNA 的准确核苷酸序列信息
    • 循环芯片测序被称为第二代测序技术
      • 第二代测序技术的优势在于
        • ①可实现大规模并行化分析。第二代测序技术一次实验可读取 40 万到 400 万条序列，总长可达 1G 到 14G 不等的碱基数
        • ②不需电泳，设备易于微型化
        • ③样本和试剂的消耗量明显降低，大大降低了测序成本
      • 第二代测序技术的最大缺点是其可靠读长短，读长通常30~450bp
      • 第二代测序技术的基本流程(以鸟枪循环芯片测序法为例)
        • ①将基因组 DNA 随机切割成为小片段 DNA
        • ②在所获小片段 DNA 分子的末端连.上接头,然后变性得到单链模板文库;
        • ③将带接头的单链小片段 DNA 文库固定于固体表面;
        • ④对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。每一个 polony 中都含有一个小片段 DNA 分子的许多个拷贝。许多这样的 polony 集合在一起就形成了 polony 芯片。这样一次测序反应就可以同时对众多的 polony 进行测序
        • ⑤针对芯片上的 DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。然后，对产生的阵列图像进行时序分析，便可获得 DNA 片段的序列。最后，按照一定的计算机算法将这些片段组装成更长的重叠群
    • 单分子测序技术被称为第三代测序技术
      • 第三代测序技术的三种策略
        • ①通过掺人并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，包括单分子实时技术(SMRT)、基于荧光供体和受体之间荧光共振能量转移(FRET)的测序技术等
        • ②利用DNA聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现单分子测序
        • ③直接读取单分子DNA序列信息，如非光学显微镜成像测序技术、纳米孔测序技术等。在第三代DNA测序技术中，目前 SMRT 较为成熟
  • 基因转录起点分析技术
    • 用 cDNA 克隆直接测序法鉴定 TSS
    • 用 5'-cDNA末端快速扩增技术鉴定 TSS
      • 简要介绍一种利用高特异性 5'-RACE 法鉴定 TSS 的技术
        • ①用碱性磷酸酶去掉总 RNA 中裸露的 5'-磷酸基团;
        • ②用烟草酸焦磷酸酶去掉mRNA的5'-帽子结构，保留一个磷酸基团
        • ③用 T4 RNA连接酶将 5'-RACE适配体连接到去帽 mRNA 的 5'-末端
        • ④以上述带有 5'-RACE 适配体的 mRNA 为模板，用逆转录酶和随机寡核苷酸引物进行逆转录合成 cDNA
        • ⑤巢式 PCR 反应：先用下游外侧基因特异性引物(GSP1)和 5'-RACE 外侧引物进行外侧 PCR 反应；然后再使用下游内侧基因特异性引物(GSP2)和 5'-RACE 内侧引物进行内侧 PCR 反应
        • ⑥通过对最终的 PCR 产物直接进行 DNA 测序或先进行 DNA 克隆后再测序，从而明确特定基因的 TSS 序列
  • 基因启动子结构分析技术
    • 用 PCR 结合测序技术分析启动子结构
    • 用核酸-蛋白质相互作用技术分析启动子结构
      • 用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点
        • 用核酸酶进行足迹分析
        • 用化学试剂进行足迹分析
      • 用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子
    • 用生物信息学预测启动子
      • 用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子
        • 启动子区域的3个部分
          • ①核心启动子
          • ②近端启动子
          • ③远端启动子
      • 预测启动子的其他结构特征
  • 基因编码序列分析技术
    • 用 cDNA 文库法分析基因编码序列
      • 以 eDNA 文库作为编码序列的模板利用 PCR 法即可将月的基因的编码序列钓取出来，如果按基因的保守序列合成 PCR 引物，即可从 eDNA 文库中克隆未知基因的编码序列；还可通过分析 PCR 产物来观察 mRNA 的不同拼接方式
    • 用 RNA 剪接分析法确定基因编码序列
      • 高通量分析 RNA 剪接的方法主要有 3 种
        • ①基于 DNA 芯片的分析法：常用的是代表外显子的 DNA 芯片或外显子/外显子交界的 DNA 片段芯片
        • ②交联免疫沉淀法：用紫外线将蛋白质和 RNA 交联在一起然后用特异性抗体将蛋白质-RNA复合物沉淀，通过分析蛋白质结合的RNA序列，便可确定 RNA 的剪接位点
        • ③体外报告基因测定法：即将报告基因克隆到载体中，使 RNA 剪接作为活化报告基因的促进因素，通过分析报告基因的表达水平,即可推测克隆片段的 RNA 剪接情况，以此为线索便可分析基因的编码序列
    • 用数据库分析基因编码序列
  • 基因拷贝数分析技术
    • DNFA 印迹
    • 实时定量PCR技术
• 基因表达产物分析技术 P444
  • 通过检测 RNA 而在转录水平分析基因表达
    • 用核酸杂交法检测 RNA 表达水平
      • 用 RNA 印迹分析 RNA 表达
      • 用核糖核酸酶保护实验分析 RNA 水平及其剪接情况
      • 用原位杂交进行 RNA 区域定位
    • 用 PCR 技术检测 RNA 表达水平
      • 用逆转录 PCR 进行 RNA 的半定量分析
      • 用实时定量 PCR 进行 RNA 的定量分析
    • 用基因芯片和高通量测序技术分析 RNA 表达水平
      • 基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法
      • 用循环芯片测序技术分析基因表达谱
  • 通过检测蛋白质/多肽而在翻译水平分析基因表达
    • 用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽
    • 用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽
    • 用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达的蛋白质/多肽
    • 用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞
    • 用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质/多肽表达水平
      • 用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱
      • 用双向电泳分析蛋白质/多肽表达谱
• 基因的生物学功能鉴定技术 P447
  • 用功能获得策略鉴定基因功能
    • 用转基因技术获得基因功能
    • 用基因敲入技术获得基因的功能
      • 基因打靶的原理
        • ①从小鼠囊胚(受精卵分裂至8个细胞左右即为囊胚，此时受精卵只分裂不分化)分离出未分化的 ES 细胞
        • ②然后利用细胞内的染色体 DNA 与导人细胞的外源 DNA 在相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有筛选标记的打靶载体，对 ES 细胞中的特定基因实施“打靶”
        • ③将“中靶”的 ES 细胞移植回小鼠囊胚，进而与囊胚一起分化发育成相应的组织和器官，最后产生出具有基因功能改变的“嵌合鼠”。由于“中靶”的ES细胞保持分化的全能性，因此它可以发育成为嵌合鼠的生殖细胞，使得经过定向改造的遗传信息可以代代相传
  • 用功能失活策略鉴定基因功能
    • 用基因敲除技术使基因功能完全缺失
    • 用基因沉默技术可使基因功能部分缺失
      • 用 RNA 干扰技术研究基因功能
      • 用 miRNA 技术研究基因功能
      • 用反义 RNA 技术研究基因功能
      • 核酶技术
  • 用随机突变筛选策略鉴定基因功能
    • 局限性:
      • 首先，由于生物体的代偿机制，使得基因敲除动物常常观察不到异常表型
      • 其次，由于“反向遗传学”只能对已
      • 知基因进行研究,而人类基因组中尚有 90% 以上的非编码序列处于未知状态
      • 第三，由于“功能缺失”和“功能获得”小鼠常出现胚胎期死亡，而目前可用于条件性基因改造的启动子还很少，从而阻碍了特定基因在成体动物中的功能分析
      • 第四，由于一个蛋白质有多个不同的功能域，特定基因在不同位点上的突变可能产生不同的表型，应用单一的“ 功能缺失”方法，显然不可能发现这些不同的异常表型