细胞生物学的研究方法

早在1925年,生物学大师Wilson就提出:“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找答案”。一图带你学尽《细胞生物学》中细胞生物学的研究方法。后续更多干货分享，可以点个收藏继续关注噢!

细胞生物学的而研究方法

显微镜技术

光学显微技术

>0.2μm

普通光学显微镜

分辨率resolution，R

相差显微镜

观察活细胞

暗视野显微镜

散射光成像

活细胞内：细胞核 线粒体

液体介质：真菌 细菌

运动

荧光显微镜

呈现强反差色的彩色图像

共聚焦激光扫描显微镜

高清彩色三维图像

细胞骨架系统的纤维 染色体 基因的排列

超分辨显微镜

Abbe限度

通常将由于光的衍射效应导致的光学显微镜分辨率极限称为Abbe限制 Abbe limit

电子显微镜技术EM

实际分辨率2nm

透射电子显微镜TEM

细胞的超微结构

标本特殊制备，过程：

固定→包埋→切片→染色

高压透射电镜

超高压电子显微镜

借助方法获取三维图像

金属投影法

冰冻断裂

冰冻蚀刻

扫描电子显微镜SEM

生物样品表面的立体结构

冷冻电镜cryo-EM

生物大分子结构

高分辨率结构生物学研究基础

1、冷冻电镜cryo-EM

2、X射线晶体学

3、核磁共振

步骤

①样品冷冻

保持蛋白质溶液态结构

子主题

② 冷冻成像

获取二维投影图像

③三维重构

计算的三维

其他显微技术

扫描探针显微镜SPM

扫描隧道显微镜STM

原子力显微镜AFM

对单个分子进行操作

分子手术

纳米显微技术

细胞的分离和培养

制备游离细胞悬液

方法

机械方法

酶解方法

消除细胞间的连接和细胞外基质

胰蛋白酶、胶原酶

细胞黏着所依赖的Ca2+离子

EDTA\EGTA】

要求

①分离体系所用的溶液必须是等渗的，要具有缓冲性的离子强度

②分离体系应保持低温，以降低细胞的代谢活动

③无菌操作

④所用的试剂、器皿需要高压灭菌或过滤除菌

分离细胞

一、密度梯度离心法

利用细胞的物理和生物学特性

二、流式细胞术

（荧光激活细胞分选仪FACS）

可从多细胞悬液中分离目的细胞

带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞

三、免疫磁珠法

高纯度细胞

带有特定单抗的免疫磁珠---结合---靶细胞

四、激光捕获显微切割技术LCM

（Laser Capture Microdissection， LCM）

冰冻石蜡切片--染色--红外激光切割

从组织切片中精确地分离一个单一的细胞

细胞培养

从机体中取出组织或细胞，模拟体内的生理环境，使之能够继续生存、生长和增殖的一种方法。

条件

营养条件

5%CO2

无菌环境

主要方式

原代培养

原代培养（primary culture）：直接取材于有机体组织的细胞培养。

传代培养

传代培养（secondary culture）：原代培养的细胞从培养瓶中取出，以1:2以上的比例的扩大培养。传代培养的细胞通常表现出其来源组织的分化特征。

体内细胞体外建系

细胞系

细胞系（cell line）：在培养的细胞中产生“不死”的变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。 细胞系的来源包括培养过程中发生转化的正常细胞和取材于肿瘤组织的原代培养细胞。

细胞株

细胞株（cell strain）：用细胞克隆化的方法进一步改善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖形成的细胞群。

细胞组分的分离和纯化技术

细胞裂解

物理方法

低渗透压

超声振荡

强制通过微孔

机械破碎

研磨

微粒体；均浆

去垢剂

离子型

十二烷基硫酸钠，SDS

非离子型

TritonX-100、NP-40

兼性离子型

CHAPS

蛋白质的抽离

离液剂

尿素

盐酸胍

DNA和RNA的抽取

细胞器及细胞组分的分级分离

1、差速离心（differential centrifugation）

方法：

从高速到低速逐级沉降。

分离对象：

体积、质量差别较大的颗粒 。

取决于颗粒大小，直径

2、速度沉降（velocity sedimentation）

方法：

在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加的蔗糖溶液密度梯度（通常5%～20%）。

分离对象：

沉降系数不同的颗粒

取决于大小形状，用沉降系数S表示

3、平衡沉降（equilibrium sedimentation）

方法：

在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的蔗糖或氯化铯溶液密度梯度。

分离对象：

密度不同颗粒

和大小形状无关，取决浮力密度

例：tRNA分子和简单的酶可以根据大小分开

蛋白质的分离和鉴定

柱层析（column chromatography）

1、离子交换层析

填充的颗粒带有正负电荷

2、凝胶过滤层析

子主题

填充的颗粒：多孔性的凝胶颗粒，根据蛋白质的大小将其分离

3、疏水性层析

填充颗粒：带有疏水基团的颗粒

原粒：疏水性不同，流出的速度不同

4、亲和层析

填充颗粒：结合有酶底物、特异性抗体或抗原的颗粒。

分离纯化重组蛋白最常用的方法

高压液相层析法HPLC

（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）

填充基质：3～10 μm的微小球型树脂。

特点：分离速度快、分离度高。

蛋白质电泳

蛋白质带有净电荷，具有不同形状、大小以及净电荷的蛋白质分子在电场中会产生不同的迁移速率，进而被分离。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

（SDS polyacrylamid gel electrophoresis ， SDS-PAGE）

加入SDS

SDS疏水+Pro疏水（排斥Pro的亲水）

加入还原剂

2-巯基乙醇（2-ME）

二硫苏糖醇（DTT）

①使Pro失去和其他Pro或脂质成分的联系 ②使Pro自身的亚单位之间的连接分开

原理：依据分子量的不同分离蛋白质

小分子比大分子通过凝胶网孔更容易，迁移速度快

等电聚焦电泳

等电点isoelectric point

当溶液在某一PH条件下使某一种蛋白质不带电荷时，这个PH值就是该蛋白质的等电点

条件：两性电解质在电场当中形成pH梯度

原理：依据等电点不同分离蛋白质

所有蛋白质电泳使都向自己的等电点处移动，聚集，静止在各自的等电点处

双向电泳

原理：等电聚焦与SDS-PAGE结合

①在长条状凝胶介质中进行等电聚焦电泳 。

②将凝胶条横放于聚合好的平板SDS-丙烯酰胺凝胶上进行垂直电泳

特点：可以一次分离千种蛋白

核酸的分离和纯化与鉴定

DNA

存在于细胞核和线粒体

细胞核

染色体DNA是长的线性分子

线粒体

环形分子

RNA

存在于细胞核和细胞质

RNA酶广泛存在，防止降解

差速离心沉淀

分离纯化

离液剂

异硫氰酸胍

释放细胞内核酸分子

质膜、蛋白变性

核酸抽提液的主要成分

蛋白酶K

水解细胞内的蛋白和膜蛋白

钠离子

中和核酸骨架负电荷==促进DNA疏水复性

乙醇+低温==沉淀DNA分子

异丙醇

降低水溶液的极性==沉淀RNA分子

硅胶膜

有效吸附溶液中的核酸分子

凝胶电泳

判定纯度、完整性、片段大小

支持体

琼脂糖agarose

特点：操作简单，电泳速度快，分辨率相对较低

建立在琼脂糖凝胶电泳的基础上（印迹杂交技术）

Southern印记杂交

Northern印记杂交

丙烯酰胺

特点：辨率高，操作相对复杂，多用于500碱基以下的DNA分子片段的分离

原理：核酸分子中的每个单核苷酸都带有一个负电荷，在电场中向阳极移动

应用：分离不同大小的DNA分子

细胞化学和细胞内分子示踪技术

细胞化学技术（cytochemistry technique）

一类将细胞形态观察和组分分析相结合的分析方法，是在保持组织原有结构的情况下利用生物大分子、小分子、无机离子的物理、化学特性来研究它们在细胞内的分布、数量及动态变化。

一、酶细胞化学技术（enzyme cytochemistry）

通过酶对特异底物的反应并显色来检测酶在器官、组织和细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术

二、免疫细胞化学技术（immunocytochemistry，ICC）

利用免疫学中抗原抗体特异性结合的原理来定性和定位研究器官、组织和细胞中的生物活性大分子的技术。

标记方法

①荧光染料标记抗体。 ②胶体金标记抗体。 ③酶标记抗体 。

反应方式：

直接反应===标记物标记一级抗体。

间接反应===标记物标记二级抗体，可增加信号强度：

三、放射自显影技术（autoradiography）

用放射性同位素标记生物样品中的大分子或其前体物质，然后通过乳胶感光（卤化银还原成为银原子），显示出被标记物在组织和细胞内的位置、数量及其变化。

同位素

核重量不同

核外电子数相同，化学性质不同

放射性同位素（radioisotope）

可衰变释放出α、β或γ射线而被检测。

常用放射性同位素

3岁张亮爱吃酸35岁耍流氓蛋 蛋 被切掉 3岁游泳爱吃甘甜的海带糖 3岁脱胸罩 胸甜尿甜核酸

操作步骤：

①放射性化合物掺入活细胞 ； ②不同时间取样制备切片； ③暗盒中曝光； ④显影和定影。

应用

对生物样品中放射性同位素标记的某种分子进行定性或定量检测。

活细胞内分子示踪

一、离子探针

作用：细胞内离子的实时监测

一些染料专一地与某种离子结合后会产生荧光或改变本身荧光的发射波长与强度，从而通过荧光检测可以显示该离子的量。

二、绿色荧光蛋白

（green fluorescent protein，GFP）

不能给出蛋白之间 相互作用的证据

作用：特定蛋白质亚细胞内定位

①构建融合基因表达载体。 ②转染细胞。 ③荧光显微镜下观察。

含有238个氨基酸残基，，在蓝色光源450-490nm的激发下发射绿色荧光520nm

常用不同激发光与发射光谱

GFP绿

YFP黄

CFP青

BFP蓝

荧光强度增强

EGFP

EYFP

ECFP

三、荧光共振能力转移

（fluorescence resonance energy transfer，FRET）

当一个荧光供体与一个荧光受体分子彼此接近而供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠时就会发生FRET现象，此时能量以非辐射方式由供体转移到受体。

应用：实时观察细胞内蛋白与蛋白相互作用。

四、单分子示踪

1、单分子荧光成像

特点 ：时间分辨率高，样品激发范围小、光子收集效率高。

成像：全内反式荧光显微镜+共焦激光扫描显微镜。

应用：活细胞内单分子研究（配体与受体的结合、蛋白质的聚合和解聚、生物大分子的动力学行为等）。

2.原子力显微镜

特点：分辨率高，适合在生理条件下显示生物分子的特异性相互作用。

细胞功能基因组学技术

一、基因表达的定量分析

1、印迹杂交技术

Northern印记杂交blot

检测组织或细胞中特异性mRNA的方法。

主要过程

① RNA提取与电泳分离 ②印迹 ③杂交 ④放射自显影分析

Western印记杂交blot

检测蛋白质分子

2、原位杂交技术ISH

（in situ hybridization，ISH）

将细胞或组织切片固定于载玻片上，使细胞中DNA或RNA在保持原来位置条件下，与标记的核酸探针进行原位杂交反应，通过放射自显影检测和显微镜观察，对材料中被杂交的核酸分子进行定位、定量分析或观察基因表达（mRNA）的水平。

3、荧光实时定量PCR技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）

是在体外对特定的DNA序列进行的重复性复制反应（扩增）。

只能定性

反应体系：

模板DNA； 耐热的DNA聚合酶； 引物； 4种脱氧核苷酸（dNTP）； 反应缓冲液。

反应步骤：

(1)95℃变性：DNA双链解离； (2)55℃退火：DNA链与引物互补结合； (3)72℃延伸：DNA聚合酶作用下的互补链合成。

荧光实时定量PCR反应（quantitative PCR，qPCR）

在PCR反应体系中加入荧光染料，在每次反应循环后，检测反应管中的荧光强度。以反应管中荧光强度达到阈值时所需的PCR反应循环个数（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。

可以定量，在PCR反应过程中测定

二、基因表达上调和下调技术

cDNA克隆（cDNA cloning）

将mRNA逆转录形成的cDNA或通过体外聚合酶链式反应得到的基因片段，插入到能进行自我复制的载体（通常是质粒）中，实现在受体细菌内大量扩增的过程。

1、外源基因

上调基因

转染（transfection）

将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。

在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达（over-expression），从而实现上调细胞中的目的基因表达。

2、RNA干扰技术(RNAi)

下调基因

1、将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默，呈现出特定基因表达降低（knock down）表型。

2、根据靶标设计短发卡RNA（ short hairpin RNA，shRNA)， 克隆到表达载体。转染后的表达载体可以表达由环袢连接的正反义互补的短干扰RNA序列，行使RNAi的作用。

3、CRISPR/Cas9基因编辑技术

基因的敲除、点突变和外源性基因的插入

全称：成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） Cas是CRISPR连接蛋白 （CRISPR associated protein）

sgRNA

是由与DNA互补的向导序列和与Cas9蛋白结合的重复互补序列组成。

Cas9

识别PAM区域并切割DNA。 特异切割后对DNA断点附近的序列进行修复，可以是非同源末端连接修复和同源重组的方式进行

三、蛋白质相互作用的研究技术

1、免疫沉淀（immuno-precipitation，IP）

验证蛋白和蛋白之间的相互作用

过程：

1、首先用偶联在凝胶颗粒或磁珠上的目的蛋白的抗体将细胞匀浆或裂解液中的目的蛋白沉淀出来，在此过程中能够与目的蛋白发生相互作用的蛋白会被同时沉淀下来。 2、然后用SDS-PAGE、免疫印迹或生物质谱对沉淀出来的蛋白进行鉴定。

体外实验方法

2、酵母双杂交（yeast two-hybridization）

筛选存在相互作用的蛋白质

是一种在体内条件下研究蛋白质相互作用的方法。

体内实验方法

3、噬菌体展示

筛选存在相互作用的蛋白质

(A)目的多肽（被筛选蛋白）呈现在噬菌体表面； (B)应用噬菌体展示技术获得可与脑瘤血管特异性结合的多肽的编码DNA的过程

四、蛋白质与核算相互作用的研究技术

1、染色体免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation,ChIP)

体内研究

DNA与蛋白质相互用的方法

2、紫外线免疫交联技术(ultraviolet crosslinking and immunprecipitation.CLIP)

研究RNA与RNA结合蛋白相互作用

五、生物芯片技术

生物芯片（biochip）

是一门由生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学等多学科交叉融合而成的高新技术，主要包括基因芯片和蛋白质芯片。

基因芯片（gene chip）

将大量特定的寡核苷酸片断作为探针，排列固定于支持物表面，与标记样品进行杂交，通过检测杂交信号强度，实现对生物样品快速、并行、高效的检测的一种技术。

流程：

芯片的设计与制备

靶基因的标记

芯片杂交

杂交信号检测

蛋白质芯片技术（protein chip）

将大量蛋白质或多肽固化于固相支持物表面，通过蛋白质-蛋白质间的相互作用（如抗原抗体反应、受体配体识别等），对样品中靶蛋白分子进行高通量检测的一种技术。

六、蛋白质组学技术（protein chip）

基本技术

双向电泳

第一向：高压电场下进行等电聚焦（IEF）。 第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

质谱

原理：

样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m／z）的差异来分离并确定样品的分子质量。

①蛋白质鉴定

1、 电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS）。

2、基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization/time-of-flight, MALDI-TOF-MS）。

②蛋白质质谱氨基酸测序

串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS） ：可测定肽片段的序列结构

即质谱联用技术

七、高通量测序技术

又称为： 深度测序和下一代测序技术

原理：

将DNA固定在芯片上，测序反应以大规模阵列形式排列，边合成边测序，不依赖于电泳， 阵列上DNA合成时的单个碱基改变所发出的荧光信号被检测器捕获并转化为一个测序峰值，从而获得序列信息。

应用

⑴ 对一个物种或个体的转录组和基因组进行细致全貌的分析。 ⑵ 与其他基因组水平研究技术的联合应用。

八、单细胞测序技术

是在单细胞水平对全基因组或转录组等进行扩增与测序的一项新技术。

原理

将分离的单个细胞的微量全基因组DNA或转录组RNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组或转录组后进行高通量测序，用于揭示细胞群体的时空差异和细胞进化关系等。

应用

各种肿瘤和许多疾病的研究和诊断，孕妇胎儿的产前诊断等。

九、模式动物个体水平的基因操作技术

常用模式动物

果蝇、线虫、斑马鱼、爪蟾、小鼠

制备转基因小鼠的主要方法

1. 把待研究的基因DNA直接注射到受精卵的细胞核中。 2. 在培养的胚胎干细胞基因组中改变或者加入一个基因，随后把有基因改变的ES细胞注入胚泡，使其成为内细胞团的一部分，是基因敲除的常用方法。