色谱分析仪器与技术

医学检验技术专业课笔记——临床检验仪器与技术思维导图，包括色谱分析仪器的原理、气相色谱仪、高校液相色谱仪三部分内容。

色谱分析仪

• 原理
  • 概念
    • 色谱法是利用混合物中各组分在互不相溶的两相（流动相和固定相）之间的分配差异使固定相对各组分的保留作用不同产生差速迁移而使混合物得到分离的一种分离分析方法。
  • 基本原理
    • 色谱法利用待分离的样品组分在两相中分配的差异而实现分离。流动相携带样品物混合流过固定于柱中或平板上的固定相表面时,混合物中各组分与固定相发生相互作用。由于混合物中不同组分的性质和结构不同,此它们与固定相之间产生的作用力的大小不同。随着流动相的流动,混合物在两相间经过反复多次的分配平衡,各组分被固定相保留的时间不同,从而按一定次序从固定相中先后流出，流出物再进行适当的检测,实现混合物中各组分的分离检测。
  • 色谱法分类
    • 气相色谱仪
      • 气相色谱法具有分辨率高、速度快、灵敏度高和选择性好等优点。但只能用于被气化物质的分离和检测,而常压下可气化或可定量转变为气化衍生物的物质，其总的比例大约只占几百万种化合物的20%左右。
    • 液相色谱仪
      • 液相色谱的样品无需气化而直接导入色谱柱进行分离和检测,适用于气化时易分解物质的分离和分析。约有70%左右的有机物可用高效液相色谱法进行分析。通常认为有机物质分子量<400Da时,用气相色谱法;在400~100Da时,用高效液相色谱法;＞1000Da时用凝胶色谱(排阻色谱)法。
    • 色谱法的特点是应用范围广，样品用量少，选择性高，效能高，灵敏度高
  • 常用术语和参数
    • 基线
      • 与时间轴平行的记录线b即为基线。它记录纯流动相流过检测器时所产生的响应,基线反映了检测器噪声随时间变化的情况。基线稳定性的判断是依据基线b与时间轴t平行或偏离的程度,稳定的基线应该是一条直线。
        • 反映仪器状态
    • 色谱峰
      • 检测器的输出信号随流入组分的浓度或质量的变化呈现一个个的峰形曲线,即为色谱峰。色谱峰所包围的面积称为峰面积,是色谱定量分析的基础,常用符号A表示。色谱峰最高点至峰底的垂直距离称为峰高,常用符号h表示。
        • 定量
    • 保留参数
      • 保留时间
        • 从进样开始到出现色谱峰最大值所需的时间
      • 死时间
        • 惰性物质组分从注入到出现峰的最高点所需要的时间
      • 死体积
        • 色谱柱内流动相的体积，在实际中包括从进样系统到检测器的体积
• 气相色谱仪
  • 气路系统
    • 可以向色谱柱提供质地洁净，流动平稳的流动相
    • 载气源和减压阀
      • 载气一般选用氦气，氮气，氢气氩气，贮存在高压气瓶中
      • 减压阀是把气体压强从10-15MPa的高压降低到0.2-0.4MPa的工作压强
    • 净化器
      • 载气中一般含有水、碳氢化合物、二氧化碳和其他惰性气体。净化器主要对载气净化，去掉其中的水分、有机烃类杂质
      • 净化程度与仪器灵敏度呈正比
  • 进样系统
    • 要求：准确定量，迅速注入
    • 载气预热器和取样器
      • 防止气化后的样品遇上冷的载气而被冷凝
      • 旋转式六通阀较为常用
    • 进样气化装置
      • 功能是接收样品后，立即使样品气化，还要不至于完全分解
  • 气相色谱柱与温度控制
    • 气相色谱柱
      • 气相色谱柱是色谱仪核心
      • 柱管以U形管，毛细管最常用
    • 温度控制
      • 温度控制对固定相很重要
      • 操作时先要知道所用固定相温度的极限，使全部操作保持在临界温度以下10-15℃进行
      • 温度不仅对样品在色谱柱上的分离过程有很大影响，对许多检测器的检测结果也有很大影响
      • 温度控制对恒温箱要求
        • 点温度的稳定性
        • 温度场的均匀性
        • 恒温范围可调控
        • 绝热性能好
        • 要有足够的可用恒温空间
    • 程序升温系统
      • 对于样品中各组分的沸点发布范围较窄时，用恒温操作
      • 对于各组分沸点相差较大时，最好程序升温
      • 程序升温
        • 线性程序
        • 非线性程序
          • 线性-恒温适于高沸点组分较多的样品的分离;恒温线性适用于低沸点组分较多的样品的分离;恒温线性-恒温适于组分沸点范围很宽的样品;多种升温速度适于复杂样品。
    • 检测器
      • 检测器性能好坏将直接影响到色谱仪分析结果的准确性
      • 氢火焰离子化检测器FII
        • 是选择性检测器，对含碳有机物较敏感
      • 电子捕获检测器ECD
        • 是浓度型检测器，具有选择性，只对具有负电荷的组分有响应，其灵敏度随电负性的增加而增加
        • 灵敏度最高，线性范围较窄，常用于痕量分析
• 高校液相色谱仪
  • 溶剂输送系统
    • • 脱气装置主要用于除去溶解在溶剂中的空气和其他气体。对溶剂的预处理还应包括去杂质,一般是通过蒸馏和真空抽滤的方法进行。
      • 高压输液泵
      • 梯度洗脱
        • 等度洗脱
          • 在样品分离过程始终采用相同的流动相和流量
          • 在样品各组分分配比的分布范围不是很宽时，效果好
        • 梯度洗脱
          • 把两种及以上洗脱液混合，是流入色谱柱的洗脱液组成作连续的改变
          • 目的是让样品的每个组分都在最佳分配系数的条件下分离出来，以获得较好峰型
      • 流量控制器
        • 为消除色谱柱反压过高对分离不好影响而设计
  • 进样系统
    • 注射器
    • 高压进样阀
      • 旋转六通阀
  • 分离系统和温度控制系统
    • 工作压力超过3.92MPa是，用不锈钢
    • 现在基本直管柱
    • 流动相
      • 流动相的选择:稳定性好,柱效率长期不变适应所采用的检测器,溶剂不要在检测器中产生干扰信号;能溶解待分离样品;清洗方便;度小,太大会降低理论塔板数,即增加分离时间。
  • 检测器
    • 紫外–可见光检测器
      • 遵循朗伯比尔定律
      • 灵敏度检测精度高，线性范围宽，响应速度快，受流量和温度波动影响小，适用于梯度洗脱及不破坏样品
      • 是一种选择性检测器
    • 二极管阵列检测器
      • 可得任意波长的色谱图，可得任意时间的光谱图，可色谱峰纯度鉴定
    • 示差折光检测器RID
      • 通过检测折射率的变化
      • 非选择性检测器，灵敏度低，不能梯度洗脱
    • 荧光检测器
      • 选择性